This protocol describes the use of multiphoton microscopy to perform long-term high-resolution, single cell imaging of the intact lung in real time using a vacuum stabilized imaging window.
ورم خبيث في المواقع الثانوية مثل الرئة والكبد والعظام هو ذلك الحدث الأليم مع معدل وفيات ما يقرب من 90٪ 1. من هذه المواقع، والرئة هو الأكثر صعوبة في تقييم باستخدام التصوير الضوئي حيوي داخلي بسبب موقف المغلقة في داخل الجسم، والطبيعة الحساسة ودورها الحيوي في الحفاظ على وظائف الأعضاء السليم. في حين طرائق السريرية (التصوير المقطعي بالإصدار البوزيتروني (PET) والتصوير بالرنين المغناطيسي (MRI) والتصوير المقطعي (CT)) قادرة على توفير صور موسع من هذا النسيج، أنها تفتقر إلى القرار اللازم لتصور الأحداث المبكرة بذر، مع بكسل واحد تتكون من ما يقرب من ألف الخلايا. النماذج الحالية من الرئة المنتشر البذر الفرضية القائلة بأن الأحداث بعد وصوله إلى الخلايا السرطانية هي حتمية من أجل البقاء والنمو اللاحق. وهذا يعني أن الوقت الحقيقي أدوات التصوير حيوي داخلي لقرار خلية واحدة 2 مطلوبة من أجل تحديد الظواهر من سل البذرليرة سورية واختبار هذه النماذج. في حين عالية الدقة التصوير الضوئي في الرئة وقد تم تنفيذ باستخدام مختلف الاستعدادات خارج الحي، هذه التجارب عادة ما تكون المقايسات واحدة وقت نقطة وعرضة للالتحف واستنتاجات خاطئة محتملة، بسبب البيئة المتغيرة بشكل كبير (درجة الحرارة، وفرة، السيتوكينات، الخ ) الناتجة عن إزالة من تجويف الصدر والدورة الدموية 3. وقد أظهرت الأعمال الأخيرة التي الوقت الفاصل بين التصوير الضوئي حيوي داخلي في الرئة سليمة ومن الممكن استخدام فراغ استقرت نافذة التصوير 2،4،5 ومع ذلك، فقد اقتصرت الأوقات التصوير التقليدية إلى ما يقرب من 6 ساعات. نحن هنا وصف بروتوكول للأداء على المدى الطويل التصوير حيوي داخلي الوقت الفاصل بين الرئة باستخدام مثل نافذة على مدى 12 ساعة. تسلسل صورة مرور الزمن تم الحصول عليها باستخدام هذه الطريقة تمكن التصور والكميات من التفاعلات خلية خلية، وديناميات غشاء ونضح الأوعية الدموية في الرئة. علينا مواصلة دescribe تقنية معالجة الصور التي تعطي رؤية واضحة غير مسبوق من الأوعية الدموية الدقيقة في الرئة.
وقد ثبت عالية الدقة التصوير الضوئي حيوي داخلي أن تكون حاسمة لفهم العديد من العمليات البيولوجية، مما يسمح للوحيدة الخلية والمعلمات الفرعية الخلوية إلى أن تقاس وكميا. في أبحاث السرطان، وقد أدى التصوير حيوي داخلي من الخلايا السرطانية واللحمية لاكتشاف العديد من التفاعلات microenvironmental 6-11 التي تكون موجودة فقط في الحيوان سليمة.
الاكتشافات حول microenvironments المرتبطة دخول الوعاء ونشر الخلايا السرطانية في سرطان الثدي باستخدام تحليل خلية واحدة التصوير الضوئي في الجسم الحي أدت حتى إلى علامات جديدة لتشخيص والاستجابة للعلاج في مرضى سرطان الثدي 12-16. تقنيات أفضل التصوير المتاحة للعرض في أعماق الأجهزة الحيوية الداخلية سليمة هي طرائق السريرية (التصوير بالرنين المغناطيسي، PET، CT) والتي توفر إطلالة رائعة على الجهاز بأكمله ويمكن أن تكشف عن الأمراض حتى قبل أن تنتج الأعراض السريرية. أنهم غير قادرين، حowever، للكشف عن المراحل الأولى من ورم خبيث والآليات الخلوية يقود تطور الورم نظرا لعدم وجود قرار خلية واحدة. بحلول الوقت الانبثاث الرئة واضحة في هذه الطرائق، فهي راسخة والمتكاثرة. ونظرا للتقدير أن 90٪ من خلايا نشر الورم التي تصل إلى الرئة إما لا البقاء على قيد الحياة 17 أو في البداية تظل نائمة 18، ومراقبة وصولها في وقت سابق بكثير مما كان متوقعا 19 سابقا، تصوير أولى خطوات الوصول والبقاء على قيد الحياة يصبح من الأهمية ل فهم عملية البذر النقيلي وتكرار نمو الورم في مواقع بعيدة.
وقد ثبت أداء هذه الملاحظات في الرئة صعب للغاية ولكن؛ وقد استخدمت الغالبية العظمى من الدراسات التصوير خارج الحي أو يزدرع الاستعدادات 20-23، والتي تعطي فقط وجهة نظر في الرئة في نقطة زمنية واحدة. في حين أن هذه الاستعدادات لا توفر معلومات مفيدةrmation، فإنها لا تعطي فهم كامل للتفاعلات، علاقة العلة والمعلول، والديناميات التي تحدث بين مختلف مكونات المكروية. عدم وجود نظام سليم الدورة الدموية (وعدم التوازن ما يصاحب ذلك من التوازن)، وفصل عن بقية نظام المناعة في الجسم يجعل من رغبة في التحقق من صحة الاستنتاجات التي تولد هذه الاستعدادات في أنسجة سليمة في الجسم الحي.
وقد أجريت العديد من المجموعات التصوير حيوي داخلي في الرئة سليمة 2،4،5،24-33 مع Wearn والألمانية كونه أول من جراحيا فضح طبقة الجنبي 24 وتيري أول من الاستفادة من نافذة التصوير زرع 25.
ارتفاع القرار التصوير في الرئة أعاق إلى حد كبير من قبل حركة مستمرة الرئة ولقد تم تطوير العديد من التقنيات للتغلب على هذا القيد. فاغنر و[فيلي] 27 درس الحركة الطبيعية في الرئة الكلابويهدف البروتوكول من العمليات الجراحية لتحديد نافذة على زرعها على المنطقة ثابتة نسبيا في حين تستخدم فاغنر فراغ في كتابه نافذة إعداد الجراحية لشل حركة الأنسجة 28. منذ ذلك الوقت، وقد تم استخدام مجموعة متنوعة من التقنيات لصورة الرئة بما في ذلك: لقط القصبات الهوائية، توقف التنفس أثناء متسلسل والتصوير بوابات، واقتناء oversampled، لصق الفص الرئة والفراغ (34). كل من هذه مزاياه وعيوبه بحيث لم يبرز أي أسلوب واحد متفوقة على 34 بلدا آخر. على سبيل المثال، لقط القصبات الهوائية وتوقف التنفس أثناء متتابعة يغير تبادل العادي من الغازات في الرئة وقد يسبب انخماص. التصوير مسور واكتساب oversampled لا يعانون من هذه العيوب ولكنها تتطلب سرعة عالية أو معدات التصوير المتخصصة التي لا يمكن الوصول إليها على نطاق واسع. وأخيرا كل من لصق الرئة وتقنية فراغ تجنب كلا من العيوب المذكورة أعلاه، ولكن قد تظهر الإصابة القوة التي يسببها القص إذا الرعاية ليست تاكداخلية. في السنوات الأخيرة، وقد تم تصغير نافذة فراغ وتكييفها للاستخدام في الفئران باستخدام متحد البؤر وmultiphoton المجهر 4،5،33 وممتازة عالية الدقة التصوير وقد تم تحقيق 2. ويلخص الجدول 1 هذا التاريخ الغني ويسلط الضوء على تلك الأوراق التي تصف الرواية التطورات في استخدام حيوي داخلي نوافذ التصوير الرئة.
يصف هذا البروتوكول استخدام موسع الوقت الفاصل بين multiphoton حيوي داخلي المجهري لورم خبيث الصورة في العيش والرئة سليمة مع أعلى دقة التحت خلوية ممكن. يتم الحصول على الصور لمدة تصل إلى 12 ساعة باستخدام مجهر multiphoton مجهزة عالية الفتحة العددية عدسة موضوعية ومتعددة أنبوب مضخم (PMT) كاشفات. وتستخدم نماذج الماوس المعدلة وراثيا لتسمية fluorescently الضامة الأم جنبا إلى جنب مع الفلورسنت عالية ديكستران الوزن الجزيئي والبروتينات transfected الخلايا السرطانية الفلورسنت (لتسمية خلايا الأوعية الدموية والأورام التواليذ). في حين أن هذا الاختيار من خلايا fluorescently المسمى يمكن تصور التفاعلات خلية بلعم الخلايا البطانية الورم وديناميكية، وهذا البروتوكول يعمل على أي سلالة من الماوس الفلورسنت أو غير الفلورسنت. بعد الاستحواذ، والقضاء على حركة الانجراف المتبقية (إن وجدت) باستخدام فيجي المساعد 35،36 والعرف وحدات الماكرو الوقت المتوسط قناة الأوعية الدموية للقضاء على اللمعان الناجم عن غير المسماة الخلايا الدموية.
في حين يركز هذا البروتوكول على الانبثاث التصوير، وتقنيات قابلة للتطبيق على العديد من العمليات البيولوجية الأخرى يمكن ملاحظتها مع التصوير ذات الدقة العالية وحيدة الخلية في الرئة.
دقة عالية في التصوير الضوئي الجسم الحي بالإضافة إلى العلامات وظيفية fluorescently المسمى مثل البروتينات والأجسام المضادة قد زاد بشكل كبير من فهمنا للتتالي النقيلي. وقد مكن ذلك التصور المباشر وتقدير من وحيدة الخلية والمعلمات الفرعية الخلوية في الخلايا السرطانية…
The authors have nothing to disclose.
This research was supported by NIH-CA100324, Einstein National Cancer Institute’s cancer center support grant P30CA013330, R01CA172451 to JWP and the Integrated Imaging Program. This technology was developed in the Gruss-Lipper Biophotonics Center and the Integrated Imaging Program at the Albert Einstein College of Medicine. We acknowledge the support of these Centers in this work. The authors thank Mike Rottenkolber, Ricardo Ibagon and Anthony Leggiadro of the Einstein machine shop for their skilled and timely craftsmanship, the laboratory of Matthew Krummel for generously sharing their window design drawings, Kevin Elicieri and Jeremy Bredfeldt for their expertise in microscopy and their amplifier recommendations and Allison Harney and Bojana Gligorijevic for informative discussions.
Nickel-Plated Brass Vacuum Regulator 1/8 NPT Female, w/ Gauge, 0 – 20" Hg Vacuum | McMaster Carr | 4172K12 | Vacuum Regulator |
Brass Barbed Hose Fitting Adapter for 1/4" Hose ID X 1/8" NPTF Male Pipe | McMaster Carr | 5346K13 | Vacuum Regulator Hose Adapter |
Pyrex Brand Filtering Flasks with Tubulation; Neck tooled for rubber stopper No. 4; Capacity: 50mL | Corning Life Sciences Glass | 5360-50 | Vacuum Flask |
Round Glass Coverslips Thickness #1.5, 0.16-0.19mm 10mm dia. | Ted Pella, Inc. | 260368 | Cover slips |
Exel International Disposable Safelet I.V. Catheters; 22gx1 in. | Exel International | 26746 | Tracheal Catheter |
PERMA-HAND Black Braided Silk Sutures, ETHICON LIGAPAK Dispensing Reel Size 2-0 | VWR | 95056-992 | String |
Liquid Super Glue, Clear, 0.14oz | Hendel Corp. | LOC1647358 | Cyano-acrylate Glue |
Tetramethylrhodamine isothiocyanate–Dextran | Sigma-Aldrich | T1287-500MG | 155kD Dextran |
Laboratory Clear Tygon PVC Tubing, 1/16" ID, 1/8" OD, 1/32" Wall Thickness, 25 ft. Length | McMaster Carr | 5155T12 | Thin Tubing & Tubing for Luer |
Crack-Resistant Polyethylene Tubing, 1/8" ID, 1/4" OD, 1/16" Wall Thickness, White, 50 ft. Length | McMaster Carr | 5181K24 | Thick Tubing |
Depillatory Lotion | Nair | – | |
Micro Medical Tubing 95 Durometer LDPE | Scientific Commodities Inc. | BB31695-PE/1 | Tubing for tail vein catheter |
30 G x 1 in. BD PrecisionGlide Needle | BD | 305128 | Needles for tail vein catheter |
Puritan Nonsterile Cotton-Tipped Swabs | Fisher Scientific | 867WCNOGLUE | |
Clear Polycarbonate Barbed Tube Fitting, Reducing Straight for 3/32" x 1/16" Tube ID | McMaster Carr | 5117k51 | Connectors between tubes |
One-Hole Rubber Stoppers | Fisher Scientific | 14-135F | Stopper for Vacuum Flask |
SHARP Precision Barrier Tips, For P-100, 100µl | Denville Scientific Inc. | P1125 | Pipette Tip |
Laboratory tape | Fisher Scientific | 159015R | |
Puralube | Henry Schein Animal Health | 008897 | Opthalmic Ointment |
Gemini Cautery Kit | Harvard Apparatus | 726067 | Cautery Pen |
Graefe Micro Dissecting Forceps; Serrated; Slight Curve; 0.8mm Tip Width; 4" Length | Roboz Surgical | RS-5135 | Forceps |
Extra Fine Micro Dissecting Scissors 4" Straight Sharp/Sharp 24mm | Roboz Surgical | RS-5912 | Sharp Scissors |
Micro Dissecting Scissors 4" Straight Blunt/Blunt | Roboz Surgical | RS-5980 | Blunt Scissors |
Wipes | Fisher Scientific | 06-666-A | Harness |
PhysioSuite System | Kent Scientific | PhysioSuite | Vitals Monitor |
1 mL Syringe, Tuberculin Slip Tip | BD | 309659 | Syringe |
Cyano acrylate | Staples | LOC1647358 | Cover Slip Adhesive |
Petroleum Jelly | Fisher Scientific | 19-086291 | Water Barrier |
Adapter Luer Cannulla 1.5-2.2mm | Harvard Apparatus | 734118 | Catheter Connector |
MouseOx oximeter, software and sensors | STARR Life Sciences | MouseOx | Pulse Oximeter |
Isoethesia (isoflurane) | Henry Schein Animal Health | 50033 | 250 mL |
Oxygen | TechAir | OX TM | |
1 x PBS | Life Technologies | 10010-023 | |
PVC Ball Valve, Push to Connect, 1/4 In | Grainger | 3CGJ7 | Vacuum Valve |
Small Animal Ventilator | Harvard Apparatus | 683 | Alternative is available from Kent Scientific: MouseVent |
OptiMEM Reduced Serum Medium | ThermoFisher Scientific | 31985062 | |
Lipofectamine 2000 Transfection Reagent | ThermoFisher Scientific | 11668019 | |
MacBlue Tg(Csf1r*-GAL4/VP16,UAS-ECFP)1Hume/J Mice | Jackson Laboratory | 026051 | |
Multiphoton Microscope | Olympus | Fluoview FV1000 | Alternative to custom built scope |
Environmental Enclosure | Precision Plastics | Chamber for FV1000 | Alternative to custom built enclosure |
Phosphate Buffered Saline | ThermoFisher Scientific | 14190136 | |
Laser Power Meter | Coherent | FieldMaxIITOP | |
Laser Power Meter Head | Coherent | PM10 | |
pcDNA3-Clover Fluorescent Protein Vector | Addgene | 40259 | |
G418 Sulfate Selective Antibiotic | ThermoFisher Scientific | 10131027 | |
MoFlo Fluorescent-Activate Cell Sorter | Beckman Coulter | XDP | |
Trypsin EDTA 1X | Corning | 25-052-Cl | |
40 µm Mesh | Falcon | 352235 | |
96 Well Plate | Costar | 3599 | |
60 mm Culture Dish | Corning | 430196 | |
10 cm Culture Dish | Corning | 353003 | |
Bovine Serum Albumin | Sigma-Aldrich | A4503 | |
Dulbecco's Phosphate Buffered Saline 1X | Corning | 21-031-CV | |
C57BL/6J Mouse | Jackson Laboratory | 000664 | |
Kim Wipes | Fisher Scientific | 06-666-A |