De longo prazo de alta resolução Intravital Microscopia no pulmão com um vácuo estabilizado Janela de imagem

Summary

Este protocolo descreve o uso de microscopia multifotônica para realizar imagens de célula única de alta resolução de longo prazo do pulmão intacto em tempo real usando uma janela de imagem estabilizada a vácuo.

Abstract

Metástases para locais secundários, tais como o pulmão, fígado e ossos é um evento traumático com uma taxa de mortalidade de cerca de 90% ^1. Desses sites, o pulmão é o mais difícil de avaliar utilizando imageamento óptico intravital devido à sua posição fechada dentro do corpo, delicada natureza eo papel vital na manutenção da fisiologia adequada. Enquanto modalidades clínicas (tomografia por emissão de positrões (PET), ressonância magnética (MRI) e tomografia computadorizada (CT)) são capazes de fornecer imagens não invasivas deste tecido, falta-lhes a resolução necessária para visualizar os primeiros eventos de semeadura, com um único pixel consistindo em quase mil células. Os modelos atuais de metastático de pulmão semeadura postulado de que eventos apenas após a chegada de uma célula de tumor são determinística para a sobrevivência e crescimento subseqüente. Isto significa que as ferramentas de imagem em tempo real intravital com resolução de célula única ² são necessários para definir os fenótipos da CEL semeadurals e testar esses modelos. Embora imagens ópticas de alta resolução do pulmão tem sido realizada utilizando várias preparações ex vivo, estas experiências são tipicamente ensaios ponto de tempo único e são susceptíveis a possíveis artefactos e conclusões erradas devido ao ambiente dramaticamente alterada (temperatura, profusão, citoquinas, etc. ) resultante da remoção da cavidade torácica e sistema circulatório ^3. Um trabalho recente demonstrou que a imagiologia óptica intravital lapso de tempo do pulmão intacto é possível usar um vácuo estabilizado janela de imagem ^2,4,5 No entanto, os tempos típicos de imagiologia têm sido limitada a cerca de 6 horas. Descrevemos aqui um protocolo para a realização de imagens intravital com lapso de tempo a longo prazo do pulmão utilizando uma tal janela ao longo de um período de 12 h. As sequências de imagens de lapso de tempo obtidos utilizando este método permitir a visualização e quantificação de interações célula-célula, a dinâmica da membrana e perfusão vascular no pulmão. Nós ainda mais dEscribe uma técnica de processamento de imagem que dá uma visão sem precedentes clara da microcirculação pulmonar.

Introduction

Imagens de Alta Resolução óptica intravital tem provado ser essencial para a compreensão de diversos processos biológicos, o que permite de uma única célula e os parâmetros de sub-celular a ser medido e quantificado. Em Cancer Research, imagens intravital de células tumorais e do estroma conduziu à descoberta de diversos interacções microambiente ^6-11 que estão presentes apenas no animal intacto.

Descobertas sobre microambientes associados com intravasation e disseminação de células tumorais no cancro da mama usando imagens de resolução óptica de uma única célula in vivo levou inclusive a novos marcadores de prognóstic....

Protocol

Todos os procedimentos descritos neste protocolo foram realizados em conformidade com as directrizes e regulamentos para o uso de animais vertebrados, incluindo a aprovação prévia do Albert Einstein College of Medicine Institutional Animal Care e do Comitê Use.

1. Geração fluorescente etiquetado Modelo rato e células tumorais

1. Preparação de 100 ml de 0,1% (w / v) de albumina de soro bovino / solução salina tamponada com fosfato (BSA / PBS) por mistura de 0,1 g de BSA com 100 ml de PBS.
2. Preparar células tumorais marcadas por fluorescência através de transfecção estável.
   NOTA: Aqui usamos células E0771-LG, um deri....

Results

Para demonstrar o tipo de resultados que podem ser conseguidos com este método, as células tumorais injectadas E0771-LG marcadas com o trevo proteína fluorescente na veia da cauda de ratinhos MacBlue ⁴⁴ em diferentes pontos de tempo antes da cirurgia. Após a cirurgia, 155 kD rodamina dextran marcado foi injectado por via intravenosa para marcar a imagem vasculatura e lapso de tempo foi realizada.

Quando imagiologia .......

Discussion

Alta resolução em imagiologia óptica vivo combinada com etiquetas marcadas fluorescentemente funcionais, tais como proteínas e anticorpos aumentou dramaticamente a nossa compreensão da cascata metastática. Ele permitiu a visualização directa e quantificação de uma única célula e os parâmetros de sub-celulares em células tumorais, células hospedeiras e o seu microambiente. Esta imagem no interior do tumor primário tem levado, por exemplo, para a descoberta de microambientes discretas que são de suporte .......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Regulador de Vácuo de Latão Niquelado 1/8 NPT Fêmea, com Manômetro, 0 - 20" Hg Aspirador	McMaster Carr	4172K12	Regulador de vácuo
Adaptador de Mangueira de Latão Farpado para Mangueira de 1/4" ID X 1/8" NPTF Tubo Macho	McMaster Carr	5346K13	Regulador de Vácuo Adaptador de Mangueira
Marca Pyrex com Tubulação; Pescoço trabalhado para rolha de borracha nº 4; Capacidade: 50 ml	Corning Life Sciences Glass	5360-50	Garrafa de Vácuo
Redonda de Vidro Espessura #1.5, 0.16 - 0.19 mm 10 mm dia.	Ted Pella, Inc.	260368	Lamínulas Exel
International Cateteres Descartáveis Safelet I.V.; 22 g x 1 pol.	Cateter Traqueal	Exel International	26746
PERMA-HAND Suturas de Seda Trançadas Pretas, ETHICON LIGAPAK Tamanho do Carretel de Dispensação 2-0	VWR	95056-992	Corda
Líquida Super Cola, Transparente, 0.14 oz	Hendel Corp.	LOC1647358	Cola de Ciano-acrilato
Tetrametilrodamina isotiocianato– Dextran	Sigma-Aldrich	T1287-500MG	155 kD
Tubo de PVC Tygon transparente de laboratório Dextran, 1/16" ID, 1/8" OD, 1/32" Espessura da parede, 25 pés de comprimento	McMaster Carr	5155T12	Thin Tubing & Tubulação para
Tubulação de Polietileno Resistente a Rachaduras Luer, 1/8" ID, 1/4" OD, 1/16" Espessura da Parede, Branco, 50 pés. Comprimento	McMaster Carr	5181K24	Tubulação grossa
Loção Depilatória		Nair-Micro
Tubo Médico 95 Durômetro LDPE	Scientific Commodities Inc.	BB31695-PE/1	Tubulação para cateter de veia caudal
30 G x 1 pol. Agulha BD PrecisionGlide	Agulhas BD	305128	para cateter de veia caudal
Puritan Nonsterile Cotton Tipped Swabs	Fisher Scientific	867WCNOGLUE
Conector de Tubo de Policarbonato Transparente com Fenda Direta, Reduzindo Reto para Tubo de 3/32" x 1/16" ID	McMaster Carr	5117k51	Conectores entre tubos Rolhas
de Borracha de Um Furo	Fisher Scientific	14-135F	Tampa para Garrafa de Vácuo
Pontas de Barreira de Precisão SHARP, Para P-100, 100 µ l	Denville Scientific Inc.	P1125	Ponta de pipeta
Fita de laboratório	Fisher Scientific	159015R
Puralube	Henry Schein Saúde Animal	008897	Pomada Oftálmica
Kit de Cauterização de Gêmeos	Aparelho de Harvard	726067	Caneta de Cauterização
Graefe Micro Dissecação Fórceps; Serrilhada; Ligeira curva; Largura da ponta de 0,8 mm; 4" Comprimento	Roboz Surgical	RS-5135	fórceps
Tesoura de Micro Dissecação Extra Fina 4" Reta Afiada/Afiada 24 mm	Roboz Surgical	RS-5912	Tesoura Afiada
Tesoura Micro Dissecante 4" Reta Blunt/Blunt	Roboz Surgical	RS-5980	Tesoura Blunt
Wipes	Fisher Scientific	06-666-A	arreio
Sistema PhysioSuite	Kent Scientific	PhysioSuite	Vitals Monitor
Seringa de 1 ml, Tuberculina Ponta Deslizante	BD	309659	Seringa
Acrilato de Ciano	Grampos	LOC1647358	Adesivo de Lamínula
Vaselina	Fisher Scientific	19-086291 Adaptador de	Barreira de Água
Luer Cannulla 1.5 - 2.2 mm	Aparelho Harvard	Conector de	Cateter
PhysioSuite MouseSTAT oxímetro de pulso	Kent Scientific		Oxímetro
de pulso Isoethesia (isoflurano)	Henry Schein Animal Health	50033	250 ml
Oxygen	TechAir	OX TM
1x PBS	Life Technologies	10010-023
Válvula de esfera de PVC, Push to Connect, 1/4 In	Grainger	Ventilador	Válvula de Vácuo
para Pequenos Animais	Harvard Apparatus	683	Alternativa está disponível na Kent Scientific: MouseVent
OptiMEM Soro Reduzido Médio	ThermoFisher Scientific	31985062
Reagente de Transfecção Lipofectamine 2000	ThermoFisher Scientific	11668019
MacBlue Tg(Csf1r*-GAL4/VP16,UAS-ECFP)1Hume/J	Ratos Jackson	Laboratory 026051
Microscópio Multifotônico	Olympus	Fluoview FV1000	Alternativa ao escopo personalizado
Câmara de	Plásticos de Precisão de Gabinete	para FV1000	Alternativa ao gabinete personalizado
Fosfato Tampolado	Solução salina ThermoFisher Scientific	14190136
Laser Power Meter	Coherent	FieldMaxIITOP
Cabeça de Medidor de Potência a Laser		Coerente PM10
pcDNA3-Clover Fluorescente Proteína Vetor	Addgene	40259
G418 Sulfato Antibiótico Seletivo	ThermoFisher Scientific	10131027
MoFlo Classificador de Células Fluorescente-Ativado	Beckman Coulter	XDP
Tripsina EDTA 1x	Corning	25-052-Cl
40 µ m Mesh	Falcon	352235
96 Placa de Poço	Costar	3599
Placa de Cultura de 60 mm	Corning	430196
Placa de Cultura de 10 cm	Corning	353003
Soro Bovino Albumina	Sigma-Aldrich	A4503
Solução salina tamponada com fosfato de Dulbecco 1x	Corning	21-031-CV
C57BL/6J Laboratório Mouse	Jackson	000664
Kim Wipes	Fisher Scientific	06-666-A