A largo plazo de alta resolución Microscopia intravital en el pulmón con una ventana de imagen vacío Estabilizado
Summary
This protocol describes the use of multiphoton microscopy to perform long-term high-resolution, single cell imaging of the intact lung in real time using a vacuum stabilized imaging window.
Abstract
La metástasis a sitios secundarios tales como el pulmón, el hígado y los huesos es un evento traumático con una tasa de mortalidad de aproximadamente el 90% 1. De estos sitios, el pulmón es el más difícil de evaluar el uso de imágenes ópticas intravital debido a su posición cerrada dentro del cuerpo, la naturaleza delicada y papel vital en el mantenimiento de la fisiología adecuada. Mientras modalidades clínicas (tomografía por emisión de positrones (PET), resonancia magnética (MRI) y tomografía computarizada (TC)) son capaces de proporcionar imágenes no invasivas de este tejido, que carecen de la resolución necesaria para visualizar los eventos de siembra tempranas, con un solo píxel que consta de casi un millar de células. Los modelos actuales de pulmón metastásico postulado de siembra que los eventos justo después de la llegada de una célula tumoral son deterministas para la supervivencia y el crecimiento subsiguiente. Esto significa que se requieren herramientas de imágenes intravital en tiempo real con la resolución de una sola célula 2 con el fin de definir los fenotipos de la cel siembrals y poner a prueba estos modelos. Si bien las imágenes ópticas de alta resolución del pulmón se ha realizado utilizando diversas preparaciones ex vivo, estos experimentos son típicamente ensayos solo punto de tiempo y son susceptibles a artefactos y posibles conclusiones erróneas debido al ambiente dramáticamente alterado (temperatura, profusión, citoquinas, etc. ) como resultado de la eliminación de la cavidad torácica y el sistema circulatorio 3. Trabajos recientes han demostrado que las imágenes ópticas intravital-lapso de tiempo del pulmón intacta es posible utilizando un vacío estabiliza 2,4,5 ventana de imagen, sin embargo, los tiempos típicos de imagen se han limitado a aproximadamente 6 horas. Aquí se describe un protocolo para la realización de formación de imágenes intravital de lapso de tiempo a largo plazo del pulmón utilizando una ventana tal durante un período de 12 horas. Las secuencias de imágenes con lapso de tiempo obtenidos utilizando este método permiten la visualización y la cuantificación de las interacciones célula-célula, dinámica de la membrana y la perfusión vascular en el pulmón. más nos dESCRIBE una técnica de procesamiento de imágenes que proporciona una visión sin precedentes clara de la microvasculatura pulmonar.
Introduction
Alta resolución de imagen óptica intravital ha demostrado ser crucial para la comprensión de muchos procesos biológicos, lo que permite de una sola célula y parámetros sub-celulares que han de medirse y cuantificarse. En la investigación del cáncer, intravital de imágenes de las células tumorales y estroma ha llevado al descubrimiento de muchas interacciones microambientales 6-11 que sólo están presentes en el animal intacto.
Descubrimientos sobre microambientes asociados con intravasación y diseminación de las células tumorales en el cáncer de mama utilizando imágenes ópticas resolución única célula in vivo, incluso ha dado lugar a nuevos marcadores de pronóstico y respuesta al tratamiento en pacientes con cáncer de mama 12-16. Las mejores tecnologías de imagen disponibles para su visualización en lo profundo de los órganos vitales internos intactos son las modalidades clínicas (MRI, PET, CT) que ofrecen excelentes vistas de todo el órgano y pueden revelar patologías, incluso antes de que produzcan síntomas clínicos. Son incapaces, hin embargo, para revelar las primeras etapas de la metástasis y los mecanismos celulares de conducción progresión del tumor debido a su falta de resolución de una sola célula. En el momento en metástasis pulmonares son visibles en estas modalidades, que están bien establecidos y proliferando. Teniendo en cuenta la estimación de que el 90% de las células diseminadas de tumores que llegan al pulmón, o bien no sobreviven 17 o inicialmente permanecen en estado latente 18, y la observación de que llegan mucho antes de lo que esperaba 19, imágenes de los primeros pasos de la llegada y la supervivencia se convierte en crucial para la comprensión del proceso de la siembra metastásica y la recurrencia del crecimiento del tumor en sitios distantes.
La realización de estas observaciones en el pulmón ha demostrado sin embargo extremadamente difícil; la gran mayoría de los estudios de imagen han utilizado preparaciones ex vivo o de explantes 20-23, que sólo dan una visión en el pulmón en puntos de tiempo individuales. Mientras que estas preparaciones proporcionan información útilconfirmación, no dan una completa comprensión de las interacciones, las relaciones de causa y efecto, y las dinámicas que se producen entre los diferentes componentes del microambiente. La falta de un sistema adecuado circulatorio (y el desequilibrio de la homeostasis concomitante) y la desconexión del resto del sistema inmunológico del cuerpo hace que sea deseoso para validar las conclusiones que estas preparaciones generan en el tejido intacto in vivo.
Muchos grupos han realizado intravital de imágenes de los pulmones intactos 2,4,5,24-33 con Wearn y alemán siendo el primer quirúrgicamente exponer la capa pleural 24 y Terry los primeros en utilizar una ventana de imagen implantable 25.
De alta resolución de imagen en el pulmón se ve obstaculizado en gran medida por el movimiento constante del pulmón y varias técnicas se han desarrollado para superar esta limitación. Wagner y Filley 27 estudiaron el movimiento natural del pulmón caninoy diseñado su protocolo quirúrgico para localizar su ventana implantado sobre una región relativamente estacionario mientras Wagner utiliza vacío en su preparación quirúrgica ventana para inmovilizar el tejido 28. Desde entonces, una variedad de técnicas han sido utilizados para la imagen del pulmón incluyendo: sujeción bronquio, apnea secuencial y de formación de imágenes cerrada, la adquisición de sobremuestreado, de encolado del lóbulo de pulmón y de vacío 34. Cada uno de ellos tiene sus ventajas y desventajas, y ninguna técnica ha surgido como superior a otro 34. Por ejemplo, de sujeción bronquios y apnea secuencial alteran el intercambio normal de gases en el pulmón y pueden causar atelectasia. imágenes cerrada y la adquisición de sobremuestreo no sufren de estos inconvenientes, sino que requieren de alta velocidad o equipos de imágenes especializado no es ampliamente accesible. Por último, tanto el encolado del pulmón y de la técnica de vacío evitar tanto de los inconvenientes mencionados anteriormente, pero pueden mostrar lesiones fuerza inducida cizallamiento si no se tiene takes. En los últimos años, la ventana de vacío se ha miniaturizado y adaptado para su uso en ratones utilizando microscopía confocal y multifotónica 4,5,33 y excelentes imágenes de alta resolución se ha alcanzado 2. La Tabla 1 resume esta rica historia y destaca aquellos documentos que describen la novela los avances en el uso de las ventanas de imagen intravital de pulmón.
Este protocolo describe el uso de prolongado lapso de tiempo de microscopía multifotónica intravital a la imagen metástasis en el vivo, pulmón intacto con la resolución más alta posible subcelular. Las imágenes se adquieren durante un máximo de 12 horas usando un microscopio multifotónica equipado con una lente de objetivo de alta apertura numérica y detectores múltiples tubo fotomultiplicador (PMT). modelos de ratones transgénicos se utilizan para la etiqueta fluorescente macrófagos nativas junto con dextrano fluorescente de alto peso molecular y las células tumorales transfectadas proteínas fluorescentes (para etiquetar las células tumorales y la vasculatura respectively). Mientras que esta elección de las células marcadas con fluorescencia permite la visualización de las interacciones célula-célula endotelial macrófagos tumorales y la dinámica, este protocolo funcionará para cualquier cepa de ratón fluorescente o no fluorescente. Después de la adquisición, el movimiento de deriva residual (si lo hay) se elimina utilizando un plugin de Fiji 35,36 y personalizados macros tiempo promedio que el canal vascular para eliminar intermitente causada por las células sanguíneas que circulan sin etiqueta.
Mientras que este protocolo se centra en la metástasis de formación de imágenes, las técnicas son aplicables a muchos otros procesos biológicos observables con imágenes de alta resolución de una sola célula en el pulmón.
Protocol
Representative Results
Discussion
De alta resolución pt imágenes ópticas vivo combinada con etiquetas funcionales marcados con fluorescencia, tales como proteínas y anticuerpos se ha incrementado dramáticamente nuestra comprensión de la cascada metastásica. Se ha habilitado la visualización directa y la cuantificación de una sola célula y los parámetros de sub-celulares en las células tumorales, las células huésped y su microambiente. Esta formación de imágenes en el tumor primario ha llevado, por ejemplo, al descubrimi…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This research was supported by NIH-CA100324, Einstein National Cancer Institute’s cancer center support grant P30CA013330, R01CA172451 to JWP and the Integrated Imaging Program. This technology was developed in the Gruss-Lipper Biophotonics Center and the Integrated Imaging Program at the Albert Einstein College of Medicine. We acknowledge the support of these Centers in this work. The authors thank Mike Rottenkolber, Ricardo Ibagon and Anthony Leggiadro of the Einstein machine shop for their skilled and timely craftsmanship, the laboratory of Matthew Krummel for generously sharing their window design drawings, Kevin Elicieri and Jeremy Bredfeldt for their expertise in microscopy and their amplifier recommendations and Allison Harney and Bojana Gligorijevic for informative discussions.
Materials
| Nickel-Plated Brass Vacuum Regulator 1/8 NPT Female, w/ Gauge, 0 – 20" Hg Vacuum | McMaster Carr | 4172K12 | Vacuum Regulator |
| Brass Barbed Hose Fitting Adapter for 1/4" Hose ID X 1/8" NPTF Male Pipe | McMaster Carr | 5346K13 | Vacuum Regulator Hose Adapter |
| Pyrex Brand Filtering Flasks with Tubulation; Neck tooled for rubber stopper No. 4; Capacity: 50mL | Corning Life Sciences Glass | 5360-50 | Vacuum Flask |
| Round Glass Coverslips Thickness #1.5, 0.16-0.19mm 10mm dia. | Ted Pella, Inc. | 260368 | Cover slips |
| Exel International Disposable Safelet I.V. Catheters; 22gx1 in. | Exel International | 26746 | Tracheal Catheter |
| PERMA-HAND Black Braided Silk Sutures, ETHICON LIGAPAK Dispensing Reel Size 2-0 | VWR | 95056-992 | String |
| Liquid Super Glue, Clear, 0.14oz | Hendel Corp. | LOC1647358 | Cyano-acrylate Glue |
| Tetramethylrhodamine isothiocyanate–Dextran | Sigma-Aldrich | T1287-500MG | 155kD Dextran |
| Laboratory Clear Tygon PVC Tubing, 1/16" ID, 1/8" OD, 1/32" Wall Thickness, 25 ft. Length | McMaster Carr | 5155T12 | Thin Tubing & Tubing for Luer |
| Crack-Resistant Polyethylene Tubing, 1/8" ID, 1/4" OD, 1/16" Wall Thickness, White, 50 ft. Length | McMaster Carr | 5181K24 | Thick Tubing |
| Depillatory Lotion | Nair | – | |
| Micro Medical Tubing 95 Durometer LDPE | Scientific Commodities Inc. | BB31695-PE/1 | Tubing for tail vein catheter |
| 30 G x 1 in. BD PrecisionGlide Needle | BD | 305128 | Needles for tail vein catheter |
| Puritan Nonsterile Cotton-Tipped Swabs | Fisher Scientific | 867WCNOGLUE | |
| Clear Polycarbonate Barbed Tube Fitting, Reducing Straight for 3/32" x 1/16" Tube ID | McMaster Carr | 5117k51 | Connectors between tubes |
| One-Hole Rubber Stoppers | Fisher Scientific | 14-135F | Stopper for Vacuum Flask |
| SHARP Precision Barrier Tips, For P-100, 100µl | Denville Scientific Inc. | P1125 | Pipette Tip |
| Laboratory tape | Fisher Scientific | 159015R | |
| Puralube | Henry Schein Animal Health | 008897 | Opthalmic Ointment |
| Gemini Cautery Kit | Harvard Apparatus | 726067 | Cautery Pen |
| Graefe Micro Dissecting Forceps; Serrated; Slight Curve; 0.8mm Tip Width; 4" Length | Roboz Surgical | RS-5135 | Forceps |
| Extra Fine Micro Dissecting Scissors 4" Straight Sharp/Sharp 24mm | Roboz Surgical | RS-5912 | Sharp Scissors |
| Micro Dissecting Scissors 4" Straight Blunt/Blunt | Roboz Surgical | RS-5980 | Blunt Scissors |
| Wipes | Fisher Scientific | 06-666-A | Harness |
| PhysioSuite System | Kent Scientific | PhysioSuite | Vitals Monitor |
| 1 mL Syringe, Tuberculin Slip Tip | BD | 309659 | Syringe |
| Cyano acrylate | Staples | LOC1647358 | Cover Slip Adhesive |
| Petroleum Jelly | Fisher Scientific | 19-086291 | Water Barrier |
| Adapter Luer Cannulla 1.5-2.2mm | Harvard Apparatus | 734118 | Catheter Connector |
| MouseOx oximeter, software and sensors | STARR Life Sciences | MouseOx | Pulse Oximeter |
| Isoethesia (isoflurane) | Henry Schein Animal Health | 50033 | 250 mL |
| Oxygen | TechAir | OX TM | |
| 1 x PBS | Life Technologies | 10010-023 | |
| PVC Ball Valve, Push to Connect, 1/4 In | Grainger | 3CGJ7 | Vacuum Valve |
| Small Animal Ventilator | Harvard Apparatus | 683 | Alternative is available from Kent Scientific: MouseVent |
| OptiMEM Reduced Serum Medium | ThermoFisher Scientific | 31985062 | |
| Lipofectamine 2000 Transfection Reagent | ThermoFisher Scientific | 11668019 | |
| MacBlue Tg(Csf1r*-GAL4/VP16,UAS-ECFP)1Hume/J Mice | Jackson Laboratory | 026051 | |
| Multiphoton Microscope | Olympus | Fluoview FV1000 | Alternative to custom built scope |
| Environmental Enclosure | Precision Plastics | Chamber for FV1000 | Alternative to custom built enclosure |
| Phosphate Buffered Saline | ThermoFisher Scientific | 14190136 | |
| Laser Power Meter | Coherent | FieldMaxIITOP | |
| Laser Power Meter Head | Coherent | PM10 | |
| pcDNA3-Clover Fluorescent Protein Vector | Addgene | 40259 | |
| G418 Sulfate Selective Antibiotic | ThermoFisher Scientific | 10131027 | |
| MoFlo Fluorescent-Activate Cell Sorter | Beckman Coulter | XDP | |
| Trypsin EDTA 1X | Corning | 25-052-Cl | |
| 40 µm Mesh | Falcon | 352235 | |
| 96 Well Plate | Costar | 3599 | |
| 60 mm Culture Dish | Corning | 430196 | |
| 10 cm Culture Dish | Corning | 353003 | |
| Bovine Serum Albumin | Sigma-Aldrich | A4503 | |
| Dulbecco's Phosphate Buffered Saline 1X | Corning | 21-031-CV | |
| C57BL/6J Mouse | Jackson Laboratory | 000664 | |
| Kim Wipes | Fisher Scientific | 06-666-A |
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