भूतल गाइडेंस और प्रकोष्ठों के Bioprinting के लिए स्वचालित रोबोट वितरण तकनीक
Summary
This protocol describes a bioprinting methodology using an automated robotic depositing system that incorporates etched topographical guidance cues with the precision deposition of a cell bearing hydrogel bioink. The printed cells are directly delivered to the etched features and are able to sense and orientate with them.
Abstract
यह पांडुलिपि सेल मार्गदर्शन सुविधाओं प्रत्यक्ष एक स्वचालित रोबोट वितरण प्रणाली का उपयोग करते हुए एक हाइड्रोजेल bioink में इन सुविधाओं के लिए कोशिकाओं की डिलीवरी के बाद की शुरूआत का वर्णन है। विशेष bioink चयनित किया गया था के रूप में यह कोशिकाओं की ओर तलछट और सुविधाओं को महसूस करने की अनुमति देता है। वितरण प्रणाली एक backpressure सहायता प्रिंट सिर का उपयोग कर हाइड्रोजेल bioinks में व्यवहार्य कोशिकाओं bioprints। हालांकि, एक तेज लेखनी या छुरी के साथ प्रिंट सिर की जगह से, वितरण प्रणाली को भी सतह नक़्क़ाशी के माध्यम से स्थलाकृतिक संकेतों बनाने के लिए नियोजित किया जा सकता है। लेखनी आंदोलन एक्स, वाई में 10 माइक्रोन के कदम और जेड दिशाओं में प्रोग्राम किया जा सकता है। नमूनों खांचे mesenchymal स्टेम सेल बोध कराता है, उन्हें प्रभावित खांचे 'दिशा के साथ संरेखण में एक लम्बी आकृति विज्ञान को अपनाने के लिए सक्षम थे। patterning सीधे लाइनों, गाढ़ा हलकों, और sinusoidal लहरों में साजिश रचने सॉफ्टवेयर का उपयोग कर बनाया जा सकता है। बाद में एक प्रक्रिया है, fibro मेंविस्फोटों और mesenchymal स्टेम सेल, एक 2% जिलेटिन bioink में निलंबित कर दिया गया एक backpressure संचालित बाहर निकालना printhead में bioprinting के लिए। सेल असर bioink तो एचिंग के लिए इस्तेमाल एक ही प्रोग्राम किया निर्देशांक का उपयोग कर मुद्रित किया गया था। bioprinted कोशिकाओं के रूप में भावना और नक्काशी खांचे की दिशा के साथ उनकी लम्बी उन्मुखीकरण के द्वारा प्रदर्शन किया नक्काशी सुविधाओं के लिए प्रतिक्रिया करने में सक्षम थे।
Introduction
सेल प्लेसमेंट की जानबूझकर patterning संस्कृतियों है कि इन विवो सेलुलर संगठन 1 में नकल के गठन के लिए सक्षम बनाता है। दरअसल, अनेक प्रकार की कोशिकाओं के बीच बातचीत में अनुसंधान उनके स्थानिक प्लेसमेंट के 2,3 के आयोजन द्वारा सहायता प्रदान की जा सकती है। अधिकांश patterning सिस्टम को बढ़ावा देने या बाद में निष्क्रिय सेल बयान के साथ सेल आसंजन को रोकने के लिए सतह संशोधन प्रक्रियाओं पर भरोसा करते हैं। Bioprinting सेल वितरण पर 1 स्थानिक और लौकिक नियंत्रण प्रदान करता है। इन कार्यों के अलावा, bioprinting ज्यामितीय जटिल scaffolds 4 पैदा करने के लिए एक तकनीकी रूप से, सीधी तेजी से और लागत प्रभावी तरीका होने के रूप में वर्णित किया गया है। यह कंप्यूटर डिजाइन सॉफ्टवेयर का इस्तेमाल करता है और निर्माण की प्रक्रिया 4 में कोशिकाओं की शुरूआत की अनुमति देता है।
इंकजेट के आधार पर या बाहर निकालना आधारित 4 Bioprinting सिस्टम दिया आधारित लेजर के रूप में अपने काम के सिद्धांतों के आधार पर वर्गीकृत किया है। बाहर निकालना bioprinting सबसे होनहार के रूप में वर्णित किया गया है क्योंकि यह एक यथार्थवादी समय सीमा के भीतर 4-6 चिकित्सकीय प्रासंगिक आकार के संगठित निर्माणों के निर्माण की अनुमति देता है। यह एक सेल असर हाइड्रोजेल bioink के यांत्रिक या वापस दबाव सहायता प्रदान की बाहर निकालना या तो द्वारा किया जाता है। यहाँ प्रस्तुत विधि में, वापस दबाव कार्यरत था। के रूप में उल्लेख किया है, कोशिकाओं को एक cytocompatible bioink में वितरित कर रहे हैं। इस तरह की एक bioink हानिकारक कतरनी तनाव के बिना उत्पादन कोशिकाओं के वितरण का समर्थन है, और गिर सकती हैं या फैल रहा है 7-10 ( "के रूप में स्याही खून" कहा जाता है) के बिना, मुद्रित ट्रेस की अखंडता को बनाए रखने के लिए पर्याप्त चिपचिपाहट का होना चाहिए।
उनकी पक्षपाती सतह के साथ कोशिकाओं की बातचीत सेलुलर व्यवहार को प्रभावित करने के लिए जाना जाता है। सतह स्थलाकृति सेल आकार, अभिविन्यास 11, और यहां तक कि phenotype नियंत्रित कर सकते हैं। विशेष रूप से, खांचे और चैनलों के निर्माण के लिए प्रेरित करने का प्रदर्शन किया गया हैएक बढ़ाया, अनेक प्रकार की कोशिकाओं पर लम्बी आकृति विज्ञान। इस आकृति विज्ञान के गोद लेने multipotent और pluripotent कोशिकाओं के phenotype प्रभावित करने के लिए पाया गया है। उदाहरण के लिए, जब खांचे पर गठबंधन, mesenchymal स्टेम सेल (एमएससी) cardiomyocytes 12,13 और संवहनी चिकनी मांसपेशियों की कोशिकाओं के प्रति भेदभाव के सबूत दिखाने सिंथेटिक 10,14-17 खत्म सिकुड़ा phenotype अपनाने।
सेल चैनल या खांचे संरेखित तरीकों में से एक नंबर के माध्यम से एक बहुलक सतह पर उत्पन्न किया जा सकता है, उदाहरण, गहरी प्रतिक्रियाशील आयन नक़्क़ाशी, इलेक्ट्रॉन बीम लिथोग्राफी, प्रत्यक्ष लेजर मुद्रण, लेजर femtosecond, photolithography और प्लाज्मा सूखी नक़्क़ाशी 18 के लिए। इन तरीकों, अक्सर समय लेने वाली हैं जटिल तंत्र की आवश्यकता होती है और उत्पन्न पैटर्न के आकार में सीमित किया जा सकता है। इसके अलावा, वे bioprinting साथ patterning सिंक्रनाइज़ नहीं है और तत्काल cellularization के लिए अनुमति नहीं है। एक स्वचालित के coordinately नियंत्रित आंदोलनवितरण प्रणाली समाधान के बयान के लिए जटिल पैटर्न का पालन कर सकते हैं। यहाँ हम कैसे microscale नियंत्रित आंदोलन सेल उन्मुखीकरण के लिए चैनल बनाने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता प्रदर्शित करता है। एक तेज लेखनी या छुरी बाहर निकालना सिरिंज के स्थान पर प्रिंट सिर से जुड़ा हुआ है और उपकरण तो साजिश रचने सॉफ्टवेयर के मार्गदर्शन में बहुलक सतह खोदना कर सकते हैं। विधि पैटर्न डिजाइन में बहुमुखी प्रतिभा प्रदान करता है और polymeric सामग्री आमतौर पर इस तरह polystyrene, PTFE, और पॉलिकैप्रोलैक्टोन के रूप में जैव अभियांत्रिकी में इस्तेमाल करने के लिए लागू है। नक़्क़ाशी के लिए बाद में एक कदम के रूप में, कोशिकाओं खरोंच खांचे को सीधे bioprinted जा सकता है। जिलेटिन bioink यहाँ उपयोग दोनों का पता लगाने को बनाए रखने और जमा कोशिकाओं नक्काशी सुविधाओं भावना के लिए अनुमति देने के लिए सक्षम था। Mesenchymal स्टेम सेल नक्काशी खांचे को bioprinted अलग लाइनों में उनके साथ बढ़ाना करने के लिए प्रदर्शन किया गया।
Protocol
Representative Results
Discussion
इस प्रक्रिया के महत्वपूर्ण कदम स्टेम कोशिकाओं के रूप में प्रक्रिया, सुविधाओं के लिए सेल अवसादन अनुमति / bioink प्रसार के बिना मुद्रित खून बह रहा कतरनी तनाव कोशिका मृत्यु बिना कोशिकाओं देने और अवांछित वंश ?…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
The work presented here is supported by the Singapore National Research Foundation under CREATE program (NRF-Technion): The Regenerative Medicine Initiative in Cardiac Restoration Therapy Research Program and by the Public Sector Funding (PSF) 2012 from the Science and Engineering Research Council (SERC) under the Agency for Science, Technology and Research (A*STAR).
Materials
| Equipment | |||
| Robotic Dispensing System | Janome | 2300N | |
| Plasma Machine | Femto Science | Covance | |
| USB Microscope | |||
| Optical Microscope | Olympus | IX71 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Software | |||
| Spreadsheet | Excel | Excel | |
| Printing Co-ordinate Software | Janome | JR C-Points | |
| Imaging Software | National Institutes of Health (NIH) | ImageJ | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Equipment | |||
| Stylus (Blade) | OLFA | AK-5 | |
| 5ml printing syringe | San-ei Tech | SH10LL-B | |
| 30G printing needle | San-ei Tech | SH30-0.25-B | |
| 1mm polystyrene sheets | Purchased locally | ||
| Fetal bovine serum | Invitrogen | 10270-098 | |
| Phosphate buffered saline | Invitrogen | ||
| Gelatin from porcine skin, Gel strength 300, Type A | Sigma Aldrich | 9000-70-8 | |
| αMEM | Invitrogen | 41061-029 | |
| Antibiotc antimycotic | Sigma Aldrich | A5955-100ML | |
| Red Fluorescent Protein Mesenchymal Stem Cells (RFP-MSCs) | Cyagen Biosciences Incorporation | RASMX-01201 |
Referências
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