Técnica Automated Robotic dispensação de Orientação da superfície e bioprinting de Células

Summary

This protocol describes a bioprinting methodology using an automated robotic depositing system that incorporates etched topographical guidance cues with the precision deposition of a cell bearing hydrogel bioink. The printed cells are directly delivered to the etched features and are able to sense and orientate with them.

Abstract

Este manuscrito descreve a introdução de características de orientação de células seguindo-se a entrega directa de células para estas funcionalidades de uma bioink hidrogel utilizando um sistema de distribuição robotizado e automatizado. O bioink particular foi selecionado como ele permite que as células para sedimentar direção e sentido os recursos. O sistema de distribuição bioprints células viáveis ​​em bioinks hidrogel usando uma cabeça de impressão de contrapressão assistida. No entanto, através da substituição da cabeça de impressão com um estilete ou bisturi afiado, o sistema de distribuição também pode ser empregada para criar pistas topográficas através de condicionamento de superfície. O movimento caneta pode ser programada em passos de 10 um nos sentidos de X, Y e Z. Os sulcos estampados foram capazes de orientar células-tronco mesenquimais, influenciando-os a adotar uma morfologia alongada em alinhamento com a direção dos sulcos. O padrão pode ser concebido usando o software de plotagem em linhas retas, círculos concêntricos, e ondas senoidais. Em um processo subsequente, fibroe blastos de células estaminais mesenquimais foram suspensos numa bioink gelatina a 2%, para bioprinting num cabeçote de extrusão accionado contrapressão. O bioink rolamento de células foi então impressa utilizando as mesmas coordenadas programadas utilizados para a decapagem. As células bioprinted foram capazes de detectar e reagir às características gravadas como demonstrado pela sua orientação alongada ao longo da direcção das ranhuras gravadas.

Introduction

A padronização deliberada de posicionamento de célula permite a formação de culturas que imitam in vivo ^uma organização celular. Na verdade, a investigação sobre a interacção entre vários tipos de células pode ser assistido por organizar a sua ^2,3 colocação espacial. A maioria dos sistemas de padrões dependem de procedimentos de modificação de superfície para promover ou prevenir a adesão celular com a deposição de células passiva subseqüente. Bioprinting oferece controle espacial e temporal sobre distribuições de células ^1. Além destas funções, bioprinting foi descrito como sendo um método tecnicamente simples, rápido e de baixo custo para a geração de andaimes geometricamente complexas ^4. Ele utiliza software de design de computador e permite a introdução de células para o processo de fabricação ^4.

Sistemas bioprinting foram classificados com base em seus princípios de trabalho como laser baseados, à base de jato de tinta ou extrusão baseados em ⁴. Extrusão bioprinting foi descrito como o mais promissor, uma vez que permite a fabricação de construções organizados de tamanhos clinicamente relevantes dentro de um período de tempo realista ^4-6. É realizada por qualquer pressão mecânica ou para trás extrusão assistida de um hidrogel bioink rolamento celular. No método aqui apresentado, foi empregue a pressão de retorno. Como mencionado, as células são entregues em um bioink cytocompatible. Tal bioink deve suportar a entrega de células sem produzir esforço de corte deletério, e ser de uma viscosidade suficiente para manter a integridade do traço impressa, sem entrar em colapso ou espalhamento (referido como "tinta de sangria") ^7-10.

A interacção das células com a superfície aderente é conhecido para influenciar o comportamento celular. A topografia da superfície pode controlar a forma das células, orientação ^11, e ainda o fenótipo. Em particular, a fabricação de sulcos e canais têm demonstrado induzirum esticado, morfologia alongada em vários tipos de células. A adopção desta morfologia foi encontrado para influenciar o fenótipo de células multipotentes e pluripotentes. Por exemplo, quando alinhadas em ranhuras, as células estaminais mesenquimais (MSC) mostram evidências de diferenciação em direcção cardiomiócitos ^12,13 e células musculares lisas vasculares adoptar o fenótipo contráctil sobre o sintética ^10,14-17.

A célula alinhando canais ou ranhuras pode ser gerado numa superfície polimérica por meio de uma série de métodos, por exemplo, gravação iónica reactivo profundo, litografia de feixe de electrões, impressão a laser directo, femtosecond laser, fotolitografia e ataque químico de plasma seco ^18. Estas abordagens são frequentemente demorados, exigem aparelhos complexos e podem ser limitante na forma do padrão gerado. Além disso, eles não sincronizar padronização com bioprinting e não permitem celularização imediata. O movimento coordenado controlada de um automatizadoSistema de distribuição pode seguir padrões complexos para a deposição de soluções. Aqui demonstramos como o movimento controlado por microescala pode ser aproveitada para criar canais para orientação de células. Uma caneta ou bisturi afiada está ligado à cabeça de impressão em lugar da seringa e o equipamento de extrusão pode, em seguida, gravar a superfície de polímero sob a orientação do software trama. O método oferece uma versatilidade na concepção padrão e é aplicável a materiais poliméricos normalmente usados ​​em bioengenharia, tais como poliestireno, de PTFE, e policaprolactona. Como um passo subsequente para a decapagem, as células podem ser bioprinted directamente aos sulcos riscados. O bioink gelatina utilizada aqui foi capaz de manter tanto o traço e permitir que as células depositadas para detectar as características gravadas. As células estaminais mesenquimais bioprinted aos sulcos gravados foram demonstrados para alongar ao longo delas em linhas distintas.

Protocol

NOTA: Este protocolo descreve a utilização de uma contra-pressão assistida sistema de distribuição robótico (Figura 1A) como uma superfície de gravação (Figura 1B) e bioprinter à base de extrusão (Figura 1C) 10. 1. Alteração de uma superfície de poliestireno Use 1 folhas mm de poliestireno desde placas de cultura de tecidos de poliestireno tendem a se curvar para cima no centro, arruinando a consistência …

Representative Results

Os resultados representativos demonstram que o sistema de dispensa robótico contrapressão assistida pode ser usado como um bioprinter à base de extrusão para a realização de ambos gravura e impressão bioink superfície (Figura 1 A). Ele pode ser usado para a geração de ranhuras gravadas em superfícies de polímeros, e, subsequentemente, para imprimir uma bioink rolamento célula directamente para as características (Figura 1 B e C). <p cla…

Discussion

O passo crítico deste procedimento é a entrega bioprinting efectiva das células estaminais enquanto o processo deve permitir a sedimentação de células para as características, de impressão sem bioink espalhando / hemorragia, proporcionam células sem morte celular tensão de cisalhamento e não desencadeiam a diferenciação no sentido linhagem indesejado.

Se o alinhamento de células esperado não ocorrer, então a viscosidade bioink deve ser avaliado quanto à sua aptidão para a i…

Materials

Equipment
Robotic Dispensing System	Janome	2300N
Plasma Machine	Femto Science	Covance
USB Microscope
Optical Microscope	Olympus	IX71
Name	Company	Catalog Number	Comments
Software
Spreadsheet	Excel	Excel
Printing Co-ordinate Software	Janome	JR C-Points
Imaging Software	National Institutes of Health (NIH)	ImageJ
Name	Company	Catalog Number	Comments
Equipment
Stylus (Blade)	OLFA	AK-5
5ml printing syringe	San-ei Tech	SH10LL-B
30G printing needle	San-ei Tech	SH30-0.25-B
1mm polystyrene sheets		Purchased locally
Fetal bovine serum	Invitrogen	10270-098
Phosphate buffered saline	Invitrogen
Gelatin from porcine skin, Gel strength 300, Type A	Sigma Aldrich	9000-70-8
αMEM	Invitrogen	41061-029
Antibiotc antimycotic	Sigma Aldrich	A5955-100ML
Red Fluorescent Protein Mesenchymal Stem Cells (RFP-MSCs)	Cyagen Biosciences Incorporation	RASMX-01201