リパーゼ及びホスホリパーゼ候補者のための基質特異性を定義します
Summary
Many predicted (phospho)lipases are poorly characterized with regard to their substrate specificities and physiological functions. Here we provide a protocol to optimize enzyme activities, search for natural substrates, and propose physiological functions for these enzymes.
Abstract
微生物は、生物のための外部の基板を利用できるようにするために分泌される（ホスホ）リパーゼの広いスペクトルを生成します。代替的に、他の（ホスホ）リパーゼは、物理的に産生する生物は、内因性の脂質の代謝回転を引き起こし、しばしば細胞膜のリモデリングを生じると関連付けることができます。電位（ホスホ）リパーゼは、遺伝子/タンパク質配列が利用可能である多くのアルゴリズムを用いて予測することができますが、酵素活性、基質特異性、および潜在的な生理機能の実験的証明は頻繁に得られていません。本稿では、未知の基質特異性とどのようにそれぞれの（ホスホ）リパーゼの天然基質の検索でこれらの最適化された条件を採用することで将来の（ホスホ）リパーゼのためのアッセイ条件の最適化について説明します。このようなp個の -nitrophenyl誘導体のような人工的な発色基質を、使用して、マイナーを検出するのを助けることができます標準的な条件下での予測（ホスホ）リパーゼのための酵素活性。このようなマイナーな酵素活性を検出しましたが、酵素アッセイの異なるパラメータは、人工基質のより効率的な加水分解を得るために変えることができます。酵素がうまく機能する条件を決定した後、潜在自然種々の基材は、その分解、明確なクロマトグラフィー法を用いて追跡することができるプロセスについてアッセイされるべきです。新しい酵素の基質特異性の定義は、頻繁にして実験的に試験することができ、これらの酵素の潜在的な生理的役割のための仮説を提供します。これらのガイドラインに続いて、我々は成長のリン制限条件に菌シノリゾビウム・メリロッティ内膜のリモデリングのための重要なステップで、ホスホコリンおよびジアシルグリセロールするホスファチジルコリンを分解するホスホリパーゼC（SMc00171）を識別することができました。 2についてpatatin-を予測同じ生物のホスホリパーゼ（SMc00930とSMc01003）のように、我々はそれらの基質特異性を再定義し、SMc01003は、ジアシルグリセロールリパーゼであることを明らかにすることができました。
Introduction
このようなトリアシルグリセロールおよび（グリセロ）リン脂質のグリセロールベースの脂質は、重要な、おそらく最もよく知られている脂質クラス1を構成しています。トリアシルグリセロール（タグは）したがって、ポテンシャルエネルギーや炭素源として油脂、通常、貯蔵脂質として機能する、としています。タグは、頻繁に外部タグを消化し、炭素源としてそれらを使用できるようにするために産生する生物によって分泌されるリパーゼによって分解することができます。また、リパーゼは広く、それらの重要なバイオテクノロジー用途2に長年にわたって研究されてきました。
それらの両親媒性の性質とその近円筒形状、（グリセロ）リン脂質を呈する膜形成特性と、通常二層膜3の主要な脂質成分を構成します。このような細菌、大腸菌 、3つだけの主要な頭部基変種、ホスファチジルグリセロール（PG）、カルジオリピン（CL）、およびphosphatidのような単純な微生物では、一つは、それらの一つ一つがかなりのSNで異なる脂肪酸アシル鎖の数-1またはSNで置換することができることに注意する必要がありますが、ylethanolamine（PE）は、検出された-2位置が異なる分子種4の多数を生じさせます。他の細菌は、他のリン脂質に加えて、またはその代わりを持っている可能性があります。例えば、マメ科植物アルファルファ（ アルファルファ ）と窒素固定根粒共生を形成することが可能であるシノリゾビウム・メリロティ 、土壌細菌は、第二の両性イオン性リン脂質をPEに加えて含んで、ホスファチジルコリン（PC）5。また、リンまたはグリセロールを含まない脂質は両親媒性であると細胞膜の一部を形成するかもしれません。例えば、リン制限増殖条件時、S.でメリロティは 、（グリセロ）リン脂質は、主としてリンを含まない膜脂質、 すなわち、スルホ脂質、オルニチン脂質、およびdiacylglyceryl trimethylhoによって置き換えられていますmoserine（DGTS）6。細菌では、DGTSは2段階経路7にジアシルグリセロール（DAG）から形成されたが、DAGの生成のためのソースが明確ではなかったされています。パルスチェイス実験は、PCは、我々はリン制限条件下で形成され、DAGとホスホコリンにPCを変換できるC（PLCP、SMc00171）ホスホリパーゼを識別することができDGTS 8の前駆体であることと、この原稿に記載の方法を用いて、可能性を示唆しました8。
別の研究では、我々はそのアシルCoAシンテターゼ（FADD）Sの欠損変異体を発見しました成長9の定常期に入るとき根粒かの大腸菌は、遊離脂肪酸を蓄積しました。これらの脂肪酸は、膜脂質に由来すると思われたが、遊離脂肪酸またはそれらの遊離酵素（群）の正確な供給源が知られていませんでした。ここでも、（、2パタチンのような10（ホスホ）リパーゼを、この原稿で概説した戦略を採用S.中の遊離脂肪酸の形成に寄与しSMc00930とSMc01003） 根粒 11は、予測されました。驚くべきことに、SMc01003は、モノアシルグリセロール、最終的にはグリセロールと遊離脂肪酸11に変換する基板としてDAGを使用しました。したがって、SMc01003はDAGリパーゼ（DGLA）です。
アルゴリズムの数を潜在的（リン）を予測するために存在するが12,13は 、リパーゼ、それらの正確な機能と生理的役割は、通常知られていません。ここでは、クローンを作成する、プロトコルの概要を説明し、予測又は電位（ホスホ）リパーゼを過剰発現します。この原稿は、酵素アッセイを開発し、人工的な発色基質を使用することにより過剰発現（ホスホ）リパーゼのために最適化する方法について説明します。私たちは、最適化された酵素アッセイで、実際の（ホスホ）リパーゼ基質に遭遇することができ、どのようにこれらの知見は、微生物生理学の我々の理解を豊かにする方法の例を提供します。
Protocol
Representative Results
Discussion
過去20年間、多くの生物のゲノムが配列決定されており、ゲノム配列データの富が生成されているが、機能的な解釈が遅れ、したがって、ゲノム機能の理解を妨げています。ゲノム中の遺伝子の機能は、多くの場合、既知の機能または保存されたモチーフの発生の遺伝子との類似性に基づいて割り当てられます。しかし、所定の遺伝子の正確な機能はしばしば知られていません。特に、酵素?…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
この作品は、（InvestigaciónエンFronterasのデ・ラ・CienciaでInvestigaciónCientíficaBASICAで82614、153998、253549、および178359だけでなく、118）とDirección一般デからConsejoナショナルデCienciasのyTecnología・メキシコ（CONACyT-メキシコ）からの助成金によってサポートされていましたAsuntosデパーソナルAcadémico-ナショナル大学自治・デ・メヒコ（DGAPA-UNAM; PAPIIT IN202616、IN203612）。
Materials
| Chloroform | JT Baker | 9180-03 | TLC analysis & Lipid extraction |
| Methanol | JT Baker | 9070-03 | TLC analysis & Lipid extraction |
| Acetic Acid | JT Baker | 9507-05 | TLC analysis & Lipid extraction |
| Hexanes | JT Baker | 9309-02 | TLC analysis & Lipid extraction |
| Diethylether | Sigma | 32203 | Enzymatic assays |
| bidistilled water | ANY | NA | Enzymatic assays |
| Tris Base | Sigma | T-1503 | Enzymatic assays |
| HCl | Baker | 9535-02 | Enzymatic assays |
| NaCl | Baker | 3624-01 | Enzymatic assays |
| Triton X-100 | Sigma | X-100 | Enzymatic assays |
| LB broth | ANY | NA | Bacterial growth, 10g tryptone + 5g yeast extract + 10g NaCl per liter of bidistilled water |
| tryptone | Becton Dickinson and Company | 211705 | Bacterial growth |
| yeast extract | Becton Dickinson and Company | 212750 | Bacterial growth |
| TY broth | ANY | NA | Bacterial growth, 8g tryptone + 3g yeast extract + 66mg CaCl2 2 H20 per liter of bidistilled water |
| CaCl2 2 H2O | Baker | 1332-01 | Enzymatic assays |
| isopropyl-β-D-thiogalactoside (IPTG) | Invitrogen | 15529-019 | Bacterial growth |
| Diethanolamine | Sigma | D-8885 | Enzymatic assays |
| MnCl2 | Sigma | 221279 | Enzymatic assays |
| Phospholipase A2 snake venom | Sigma | P0790 | Enzymatic assays |
| Phospholipase C Clostridium perfingrens | Sigma | P7633 | Enzymatic assays |
| Bis-p-nitrophenyl phosphate | Sigma | 07422AH | Enzymatic assays |
| p-nitrophenyl stearate | Sigma | N3627 | Enzymatic assays |
| p-nitrophenyl dodecanoate | Sigma | 61716 | Enzymatic assays |
| p-nitrophenyl decanoate | Sigma | N0252 | Enzymatic assays |
| p-nitrophenyl palmitate | Sigma | N2752 | Enzymatic assays |
| p-nitrophenyl butyrate | Sigma | N9876 | Enzymatic assays |
| p-nitrophenyl octanoate | Sigma | 21742 | Enzymatic assays |
| Acetic Acid, sodium salt [1-14C] | Perkin Elmer | NEC084 | Bacterial growth |
| dimethylsulfoxide (DMSO) | JT Baker | 9224-01 | Enzymatic assays |
| Aluminium HPTLC silica gel 60 plates. Silica gel HPTLC plates size 20 x 20 cm, 25 sheets. | Merck | 105547 | TLC analysis & Lipid extraction |
| Spectrometer UV/VIS Lambda 35 | Perkin Elmer | NA | Enzymatic assays |
| Storm 820 Phosphorimager | Molecular Dynamics | NA | Photostimulable Luminescence scanner |
| Multipurpose Scintillation Counter | Beckman Coulter | NA | Radioactivity Quantification |
| French Pressure Cell | ThermoSpectronic | NA | Breakage of cells |
| chromatography paper 3MM Chr | Whatman | 3030917 | TLC analysis |
| Sinorhizobium meliloti 1021our | reference 34 | studied strain | |
| Escherichia coli BL21 (DE3) pLysS Competent cells | Novagen | 69451 | protein expression strain |
| pET9a vector | Novagen | 69431 | protein expression vector |
| pET17b vector | Novagen | 69663 | protein expression vector |
| sterile polystyrene round-bottom tube (14 ml) Falcon | Becton Dickinson | 352057 | radiolabeling of bacterial cultures |
| polypropylene microcentrifuge tubes (1.5 ml) | Eppendorf | 30125.15 | Enzymatic assays |
| 1,2-dipalmitoyl-sn-glycerol | Sigma | D9135 | lipid standard |
| L-α-phosphatidylcholine, dipalmitoyl | Sigma | P6267 | lipid standard |
| DL-α-monopalmitin | Sigma | M1640 | lipid standard |
| palmitic acid | Sigma | P0500 | lipid standard |
Referências
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