نموذج الحاد الشبكية لتقييم الدم الشبكية الحاجز خرق والمحتملة أدوية لعلاج
Summary
منخفضة التكلفة، يتم تأسيس نظام سهل الاستخدام وقوي لتقييم العلاجات المحتملة التي يمكن أن تحسن خرق الدم حاجز الشبكية الناجم عن الهستامين. وتستخدم تسرب الأوعية الدموية، تنشيط الخلايا مولر واستمرارية العمليات العصبية لتقييم استجابة الضرر وانعكاس مع دواء المحتملة، lipoxin A4.
Abstract
A low-cost, easy-to-use and powerful model system is established to evaluate potential treatments that could ameliorate blood retinal barrier breach. An inflammatory factor, histamine, is demonstrated to compromise vessel integrity in the cultured retina through positive staining of IgG outside of the blood vessels. The effects of histamine itself and those of candidate drugs for potential treatments, such as lipoxin A4, are assessed using three parameters: blood vessel leakage via IgG immunostaining, activation of Müller cells via GFAP staining and change in neuronal dendrites through staining for MAP2. Furthermore, the layered organization of the retina allows a detailed analysis of the processes of Müller and ganglion cells, such as changes in width and continuity. While the data presented is with swine retinal culture, the system is applicable to multiple species. Thus, the model provides a reliable tool to investigate the early effects of compromised retinal vessel integrity on different cell types and also to evaluate potential drug candidates for treatment.
Introduction
وهناك مجموعة متزايدة من الأدلة تؤيد وجود حاجز الشبكية الدم (BRB) 1-5 وتشابهه مع حاجز الدم في الدماغ (BBB) 6،7. حل وسط من BBB وقد تم ربط بإحكام سببيا أو كعلامة التشخيصية للأمراض العصبية المزمنة مثل مرض الزهايمر (م) 8،9 الحادة والظروف مثل الهذيان 10. ما يعرقل رؤى الآلية إلى هذه الأمراض والاكتشافات للأهداف المخدرات المحتملة عموما إمكانية الوصول وشبكة محدود تعقيد الدماغ. تم إنشاء بدائل مثل التصوير في الجسم الحي 11 والدماغ ثقافة عضوي النمط 12 والثقافات الخلية الأولية 13،14 وأنظمة ثقافة مشتركة 15. ومع ذلك، فإن معظم هذه النماذج تتطلب أدوات خاصة، وفترات تجريبية طويلة أو علامات متعددة لتحديد الخلايا. أوجه التشابه وظيفية وهيكلية بين BBB وBRB فضلا عن وجود علاقة بين دىوقد جادل sfunctions من الاثنين 16-19. وبالإضافة إلى ذلك، سمحت سهولة الوصول، أنواع الخلايا واضحة المعالم وبنية الطبقات الشبكية جيدا اتسم باعتبارها نافذة إلى الدماغ. تبقى هويات الهيكلية والوظيفية للBBB وBRB يمكن مقارنتها في التفاصيل. ومع ذلك، أمراض الشبكية، وخصوصا الخرق BRB، وأيضا ارتبط بشكل وثيق مع تطور الأمراض المختلفة، بما في ذلك مرض السكري 18-19 و21،22 م. وبالتالي، فإنه من مصلحة لإنشاء نظام الخلل BRB ليس فقط لتحديد آلية ولكن أيضا لفحص المخدرات المحتملة. في هذا التقرير، تم تطوير بروتوكول تمكين BRB الخلل باستخدام الثقافة الشبكية حادة بسيطة وقدم.
وقد أنشئت زيادة نفاذية BBB والتغيرات المرضية مثل م في ثقافة عضوي النمط الدماغ المحتضنة مع الهستامين، وسيط الموالية للالتهابات 12. لذلك، في نظام المقدمة، كان الهستامين تطبيق ورقةالعبوات الناسفة على الثقافة الشبكية خارج الجسم للحث على ضعف BRB. شبكية العين من عدة أنواع، مثل العضلة المصحف وبوس الثور، قد تم اختبارها. نظرا لتوافرها التجاري وتشابه إلى الأنسجة البشرية، استخدمت مقل العيون الخنازير جديدة لتوفير البيانات المبلغ عنها هنا. بعد تفرخ مع الهستامين و / أو غيرها من المخدرات، ومعالجة شبكية العين للتقييم من قبل المناعية لعدة بروتينات 12، مثل المناعي G (مفتش)، واحدة من المكونات الرئيسية في الدم. ييفي الدبقية البروتين الحمضية (GFAP)، علامة معروفة لتفعيل الدبقية. ويرتبط أنيبيب بروتين 2 (MAP2)، وهي الخلايا العصبية المحددة البروتين هيكل الخلية ضروري لتجميع أنيبيب. وعلاوة على ذلك، فإن هيكل الطبقات الشبكية يسمح تحليلا مفصلا لعمليات الخلايا مولر والخلايا العقدية، مثل التغيرات في العرض والاستمرارية. هكذا هي عدة معايير إضافية لتقييم الآثار المترتبة علىخرق BRB في مرحلة مبكرة، وتقييم الآثار عكس العلاجات المحتملة كذلك.
في هذا البروتوكول، ويتم تقييم الآثار المحتملة عكس المخدرات فحص من ثلاث زوايا: تسرب الأوعية الدموية (BVS)، وتنشيط الخلايا الدبقية والضرر للاستجابة الخلايا العصبية. وتستخدم عدة أساليب القياس الكمي، على سبيل المثال، فإن مستوى التعبير أظهرت من شدة المناعية، وقياس عرض لعملية واستمرارية العمليات العصبية التي أبداها عامل تصفية تعزيز. لتوضيح أفضل طريقة وللمساعدة في تفسير النتائج، lipoxin A4 (LXA4)، وهو مركب توليفها التطور الطبيعي في الاستجابة لإصابة التهابات وتخفيف الخلايا البطانية 23، وقد تم اختيار لأغراض العرض التوضيحي.
Protocol
Representative Results
Discussion
In this report, we present a powerful ex vivo acute retinal model of BRB dysfunction using the swine retina. This model system does not require special instruments and can be easily adapted under most laboratory settings. However, to obtain a successful result, several steps require close attention. After obtaining the eyeballs from the source, they must be kept at 4 °C or on ice and processed as soon as possible. When the effect of a treatment is being analyzed, two halves of the same retina must be used -…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Bringhurst Meats (Berlin, NJ) is acknowledged for their genuine help in providing the swine eyeballs.
Materials
| DMEM | Life Technologies | 11965-092 | |
| HBSS | Life Technologies | 14170-112 | |
| Sucrose | J.T.Baker | 4072-05 | |
| Histamine | Sigma | H7125-1G | |
| Penicillin-Streptomycin | Invitrogen | ||
| PFA | Electron Microscopy Sciences | 15710 | |
| Freezing Media | Triangle Biomedical Sciences | TFM-5 | |
| Normal Goat Serum | Rockland | D104-00-0050 | |
| Triton X-100 | Sigma | T8787 | |
| GFAP Antibody | Millipore | AB5804 | |
| MAP2 Antibody | EMD Millipore | MAB3418 | |
| FITC conjugated Donkey anti-rabbit IgG | Jackson ImmunoResearch Laboratories, Inc. | 711-095-152 | |
| Cy3 conjugated Donkey anti-mouse IgG | Jackson ImmunoResearch Laboratories, Inc. | 715-165-150 | |
| mounting medium containing DAPI | Vector Laboratories, Inc. | H-1200 | |
| Laser Confocal Microscope | Nikon | Eclipse Ti microscope | |
| ImageJ | National Institutes of Health | 1.45s |
Referências
- Cunha-Vaz, J., Bernardes, R., Lobo, C. Blood-retinal barrier. J Ophthalmol. 21, 3 (2011).
- Kim, J. H., et al. Blood-neural barrier: intercellular communication at glio-vascular interface. J Biochem Molec Biol. 39, 339-345 (2006).
- Kumagai, A. K. Glucose transport in brain and retina: implications in the management and complications of diabetes. Diabetes Metab Res Rev. 15, 261-273 (1999).
- Runkle, E. A., Antonetti, D. A. The blood-retinal barrier: structure and functional significance. Methods Molec Biol. 686, 133-148 (2011).
- Takata, K., Hirano, H., Kasahara, M. Transport of glucose across the blood-tissue barriers. Int Rev Cytol. 172, 1-53 (1997).
- Goncalves, A., Ambrosio, A. F., Fernandes, R. Regulation of claudins in blood-tissue barriers under physiological and pathological states. Tissue Barriers. 1, 24782 (2013).
- Patton, N., et al. Retinal image analysis: concepts, applications and potential. Prog Ret Eye Res. 25, 99-127 (2006).
- Di Marco, L. Y., et al. Vascular dysfunction in the pathogenesis of Alzheimer’s disease–A review of endothelium-mediated mechanisms and ensuing vicious circles. Neurobiol Dis. 82, 593-606 (2015).
- Nagele, R. G., et al. Brain-reactive autoantibodies prevalent in human sera increase intraneuronal amyloid-beta(1-42) deposition. J Alzheimer’s Dis: JAD. 25, 605-622 (2011).
- Goldwaser, E., Acharya, N., Nagele, R. Cerebrovascular and blood-brain barrier compromise: A mechanistic link between vascular disease and Alzheimer’s disease subtypes of neurocognitive disorders. J Parkinsons Dis Alzheimer’s Dis. 2, 10 (2015).
- Horton, N. G., et al. In vivo three-photon microscopy of subcortical structures within an intact mouse brain. Nat Photonics. 7, (2013).
- Sedeyn, J. C., et al. Histamine Induces Alzheimer’s Disease-Like Blood Brain Barrier Breach and Local Cellular Responses in Mouse Brain Organotypic Cultures. Biomed Res Int. 2015, 937148 (2015).
- Avdeef, A., Deli, M. A., Neuhaus, W., Di, L., Kerns, E. H. . Blood-Brain Barrier in Drug Discovery: Optimizing Brain Exposure of CNS Drugs and Minimizing Brain Side Effects for Peripheral Drugs. , 188 (2014).
- Eigenmann, D. E., et al. Comparative study of four immortalized human brain capillary endothelial cell lines, hCMEC/D3, hBMEC, TY10, and BB19, and optimization of culture conditions, for an in vitro blood-brain barrier model for drug permeability studies. Fluids Barriers CNS. 10, 33 (2013).
- Takeshita, Y., et al. An in vitro blood-brain barrier model combining shear stress and endothelial cell/astrocyte co-culture. J Neurosci Methods. 232, 165-172 (2014).
- Alberghina, M., Lupo, G., Anfuso, C. D., Moro, F. Palmitate transport through the blood-retina and blood-brain barrier of rat visual system during aging. Neurosci Lett. 150, 17-20 (1993).
- Hosoya, K., Yamamoto, A., Akanuma, S., Tachikawa, M. Lipophilicity and transporter influence on blood-retinal barrier permeability: a comparison with blood-brain barrier permeability. Pharm Res. 27, 2715-2724 (2010).
- Minamizono, A., Tomi, M., Hosoya, K. Inhibition of dehydroascorbic acid transport across the rat blood-retinal and -brain barriers in experimental diabetes. Biol Pharm Bull. 29, 2148-2150 (2006).
- Serlin, Y., Levy, J., Shalev, H. Vascular pathology and blood-brain barrier disruption in cognitive and psychiatric complications of type 2 diabetes mellitus. Cardiovasc Psychiatry Neurol. 2011, 609202 (2011).
- Kolb, H. How the retina works – Much of the construction of an image takes place in the retina itself through the use of specialized neural circuits. Am Sci. 91, 28-35 (2003).
- Ikram, M. K., Cheung, C. Y., Wong, T. Y., Chen, C. P. Retinal pathology as biomarker for cognitive impairment and Alzheimer’s disease. J Neurol Neurosurgery Psychiatry. 83, 917-922 (2012).
- Tan, Z., Ge, J. Amyloid-beta, the retina, and mouse models of Alzheimer disease. Am J Pathol. 176, 2055 (2010).
- Serhan, C. N. Pro-resolving lipid mediators are leads for resolution physiology. Nature. 510, 92-101 (2014).
- Bucolo, C., et al. Effects of topical indomethacin, bromfenac and nepafenac on lipopolysaccharide-induced ocular inflammation. J Pharm Pharmacol. 66, 954-960 (2014).
- Edelman, J. L., Lutz, D., Castro, M. R. Corticosteroids inhibit VEGF-induced vascular leakage in a rabbit model of blood-retinal and blood-aqueous barrier breakdown. Exp Eye Res. 80, 249-258 (2005).
