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Artigo de método

Um Modelo aguda da retina para a Avaliação sanguíneos da retina barreira Descumprimento e potenciais fármacos para o tratamento

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DOI:

10.3791/54619

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13 de setembro de 2016

 ,  ,  , 
1Graduate School of Biomedical Sciences, Rowan University, 2Department of Cell Biology, Rowan University School of Osteopathic Medicine

Neste artigo

Resumo

Um baixo custo, o sistema easy-to-use e poderoso é estabelecida para avaliar potenciais tratamentos que possam amenizar violação sangue barreira retina induzida pela histamina. vazamento dos vasos sanguíneos, a ativação de células Müller e a continuidade dos processos neuronais são utilizados para avaliar a resposta a danos e sua reversão com uma droga potencial, lipoxina A4.

Resumo

Um sistema modelo poderoso, fácil de usar e de baixo custo é estabelecido para avaliar possíveis tratamentos que possam melhorar a violação da barreira retiniana sanguínea. Um fator inflamatório, a histamina, demonstrou comprometer a integridade dos vasos na retina cultivada por meio da coloração positiva de IgG fora dos vasos sanguíneos. Os efeitos da própria histamina e dos medicamentos candidatos a tratamentos potenciais, como a lipoxina A4, são avaliados usando três parâmetros: vazamento de vasos sanguíneos via imunomarcação de IgG, ativação de células de Müller via coloração GFAP e alteração nos dendritos neuronais por meio de coloração para MAP2. Além disso, a organização em camadas da retina permite uma análise detalhada dos processos de Müller e das células ganglionares, como mudanças na largura e continuidade. Embora os dados apresentados sejam com cultura de retina suína, o sistema é aplicável a várias espécies. Assim, o modelo fornece uma ferramenta confiável para investigar os efeitos iniciais do comprometimento da integridade dos vasos retinianos em diferentes tipos de células e também para avaliar potenciais candidatos a medicamentos para tratamento.

Introdução

Um crescente corpo de evidências suportam a existência de barreira retiniana sanguínea (BRB) 1-5 e a sua semelhança com a barreira hemato-encefálica (BHE) 6,7. Compromisso da BHE foi firmemente ligado causalmente ou como um marcador diagnóstico para doenças neurodegenerativas crónicas tais como a doença de Alzheimer (AD) e 8,9 agudas condições tais como delírio 10. percepções mecanicistas para estas patologias e descobertas para alvos potenciais da droga são geralmente prejudicada pela acessibilidade e rede limitada complexidade do cérebro. Alternativas tais como imagiologia in vivo 11, cérebro cultura organotípica 12, as culturas de células primárias 13,14 e sistemas de co-cultura com 15 ter sido gerado. No entanto, a maioria destes modelos requerem instrumentos especiais, períodos experimentais longos ou múltiplos marcadores para identificar células. semelhanças estruturais e funcionais entre a certificação e BRB, bem como uma correlação entre o dysfunctions de os dois têm sido argumentado 16-19. Além disso, um acesso mais fácil, tipos celulares bem definidos e uma estrutura em camadas da retina têm permitido bem caracterizado como uma janela para o cérebro. As identidades estruturais e funcionais da BHE e BRB continuam a ser comparado em pormenor. No entanto, as patologias da retina, principalmente a quebra BRB, também foram fortemente associada com a progressão de várias doenças, incluindo a diabetes e 18-19 21,22 AD. Assim, é de interesse para estabelecer um sistema de disfunção BRB não só para delinear o mecanismo, mas também para pesquisar potenciais drogas. Neste relatório, um protocolo que permite a disfunção BRB usando uma cultura aguda de retina simples é desenvolvida e apresentada.

O aumento da permeabilidade da BHE e alterações patológicas ad como foram estabelecidas em uma cultura organotípica cérebro incubadas com histamina, um mediador pró-inflamatório 12. Portanto, no sistema apresentado, a histamina foi Applied para a cultura ex vivo para induzir disfunção da retina BRB. Retinas de várias espécies, como Mus musculus e Bos Taurus, foram testados. Devido à sua disponibilidade comercial e semelhança com o tecido humano, globos oculares suínos frescos foram utilizados para fornecer os dados aqui relatados. Após incubação com histamina e / ou outras drogas, as retinas foram processadas para avaliação por imunocoloração para várias proteínas de 12, tais como a imunoglobulina G (IgG), um dos principais componentes do sangue; proteína ácida fibrilar glial (GFAP), um marcador conhecido para a activação da glia; e proteína associada a microtúbulos 2 (MAP2), uma proteína do citoesqueleto específica para neurónios essencial para a montagem dos microtúbulos. Além disso, a estrutura em camadas da retina permite uma análise detalhada dos processos de células de Muller e células ganglionares, tais como alterações na sua largura e continuidade. Assim, vários parâmetros adicionais estão disponíveis para avaliar as consequências daBRB violação numa fase inicial e para avaliar os efeitos de reversão de potenciais tratamentos também.

Neste protocolo, os efeitos potenciais de inversão de drogas crivados são avaliadas a partir de três pontos de vista: o vazamento dos vasos sanguíneos (BVS), a activação das células da glia e os danos-resposta de células neuronais. Vários métodos de quantificação são utilizados, por exemplo, o nível de expressão mostrado pela intensidade da imunocoloração, medição da largura de um processo e de continuidade de processos neuronais mostrados por um filtro de reforço. Para melhor ilustrar o método e para ajudar a interpretar os resultados, da lipoxina A4 (LXA4), um composto sintetizado endogenamente em resposta a uma lesão inflamatória e atenuando a disfunção endotelial 23, foi escolhida para fins de demonstração.

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Protocolo

Todos os protocolos foram realizados em conformidade com as políticas do Comitê animal Institucional Cuidado e Uso quando aplicável.

1. Preparação

  1. Preparar os meios de estabilização com 75% de Dulbecco Modified Eagle Médium (DMEM), 25% de Hanks Solução Salina Equilibrada (SSHE). Misture bem, alíquota e armazenar a -20 ° C até à sua utilização.
  2. Prepara-se o tampão fosfato salino (PBS) e esterilizar em autoclave. Guardar a solução à temperatura ambiente. Aquece-se a PBS para 37 ° C antes da experiência (5 ml por poço).
  3. Preparar 10%, 20% e 30% de sacarose em PBS. Filtrar todas as soluções individualmente mais separados 0,22 filtros para esterilização. Salvar as soluções a 4 ° C.
  4. Preparar a solução de estoque de histamina em PBS a uma concentração de 90 mM. Esterilizar a solução por filtração através de um filtro de 0,22 um. Alíquotas e guardar a solução a -80 ° C. Evitar ciclos múltiplos de congelação-e-descongelação.
  5. Adicione fresco paraformaldeído a 4% (PFA) em PBS antes da experiência. Colocá-lo em gelo.
    Cuidado: Mantenha PFA em um exaustor e usar equipamento de protecção adequado.
  6. Descongelar o meio de estabilização (20 ml por retina). Adicionar penicilina-estreptomicina a uma concentração final de 100 U / mL. parte quente do meio (15 ml por retina) a 37 ° C na incubadora antes da experiência. Deixar o resto do meio em gelo.
  7. Coloque a HBSS (10 ml por retina) em gelo.

2. Retinal Cultura organotípicas

  1. Transferir as amostras de um capuz de cultura de tecidos. Abra a viseira cortando ao redor da lente. Usando um pincel, retire suavemente o humor vítreo, sem puxar a retina. Suavemente descolar a retina a partir do bordo de corte com uma escova para expor o disco óptico. Severa do nervo óptico com uma navalha e solte a retina.
  2. Transferir a retina em uma placa de Petri e lavar cuidadosamente a retina uma vez usando fria HBSS. Colocar a amostra no HBSS na ice. Dissecar como muitos retinas, conforme necessário, repetindo Etapa 2.1 e este passo.
  3. Cortar a retina ao meio simetricamente com uma navalha. Suavemente transferir amostras para uma placa de 6 cavidades com 3 mL de meios de estabilização por poço. Permitir o equilíbrio durante 30 minutos a 37 ° C numa incubadora com atmosfera contendo 5% de CO 2.
  4. Preparar os seguintes reagentes durante a incubação no Passo 2.3: Diluir solução-mãe de histamina para a concentração desejada (450 uM) em meio morno. Dissolve-LXA4 (armazenada sob atmosfera de árgon) para o meio a uma concentração final de 250 ng / ml.
    Nota: Quando se mede o efeito de LXA4, uma metade de um único retina é usado só por histamina, enquanto que a outra metade é usado para a histamina com LXA4.
  5. Aspirar o meio e adicionar estabilização cuidadosamente o meio preparado a cada poço (3 ml por cavidade). Incubar as amostras a 37 ° C durante 1 hora numa incubadora com atmosfera contendo 5% de CO 2.
  6. Lavar oamostras de uma vez em água morna, PBS estéril.

3. Prepare as amostras para imunocoloração

  1. Aspirar PBS a partir das placas. Adicionar PFA a 4% (3 ml por cavidade) e incuba-se durante 15 min à temperatura ambiente.
  2. aspirar rapidamente a PFA. Lavar as amostras de uma só vez utilizando PBS. Transferir as amostras a 10% de sacarose (5 ml) por poço e incubar durante 2 a 4 horas a 4 ° C.
  3. Transferir as amostras para uma sacarose a 30% (5 ml por poço) e incubar durante a noite a 4 ° C. Misturar uma parte do meio de congelamento comercial, com duas partes de 20% de sacarose para tornar o meio de congelação de trabalho. Deixe que a 4 ° C durante a noite ou mais tempo até que as bolhas de ar desaparecer.
  4. Transferir as amostras para o meio de congelação de trabalho e permitir o equilíbrio durante 5 min à temperatura ambiente. Apare cada retina em retângulos (cerca de 3 mm por 5 mm).
  5. transferir cuidadosamente as amostras para o meio de congelação de trabalho contido num recipiente cilíndrico (cerca de 1 cm de raio x 2 cm de altura) devzada da folha de alumínio. Assegure-se que as fatias de retina são verticais (orientada para proporcionar um corte transversal da retina após o corte) e congelá-los em azoto líquido. Guardar os blocos a -80 ° C até à sua utilização.
  6. Seção cada bloco em um criostato em 14 mm fatias grossas e montar as secções em lâminas de vidro. Armazenar as lâminas a -80 ° C até à sua utilização.

4. A imunocoloração

  1. Lavam-se as secções com tampão de fosfato de 5% de sacarose (SPB, 5% de sacarose em PBS, pH 7,4) uma vez. Bloquear os locais de ligação não específicos por incubação das secções em tampão de bloqueio (5% SPB com 10% de soro normal de cabra e 0,5% de Triton X-100) durante 1 h à temperatura ambiente.
  2. Incubam-se as secções em lâminas () com o anticorpo primário apropriado (GFAP ou MAP2, diluído a 1: 500 em tampão de bloqueio) durante 1 h. Aspirar a solução. Lavar três vezes em 5% SPB. Para a coloração da IgG endógena, ignore este passo.
  3. Incubar as secções com o secon correspondentedary anticorpos (IgG anti-ratinho / anti-coelho de burro conjugado Cyanine3 / FITC, diluída a 1: 800 no tampão de bloqueio) durante 1 h.
  4. Lavam-se as secções cuidadosamente com 5% SPB três vezes. Preparar as amostras para microscopia por montá-los no meio de montagem contendo DAPI e cobrindo com lamelas.
  5. Usando um laser microscópio confocal, capturar imagens através de uma lente de 20X sob parâmetros idênticos, como a intensidade do laser, o valor ganho, tempo de permanência, etc. entre os grupos. Definir os comprimentos de onda de excitação / emissão para o canal azul (para detectar DAPI) como 408/447 nm, para o canal vermelho (para detectar Cyanine3) como 561/785 nm e para o canal verde (para detectar FITC) como 488/525 nm .

Análise 5. Imagem

  1. Quantificar percentagem de vasos sanguíneos com vazamentos de acordo com os seguintes critérios 12: Inclua apenas os vasos sanguíneos com os núcleos das células endoteliais dentro do plano de corte na contagem; considerar um leaky vasos sanguíneos se mostra agradient de imunocoloração em torno do navio.
  2. Para determinar o nível de expressão, selecione regiões de interesse e medir o valor de cinza média usando o software de análise de imagem.
  3. Para medir a largura do processo, escolher uma área de secção em que os processos são distintos (a camada externa nuclear, ONL, por exemplo). Em seguida, escolha um campo óptico, onde tais processos são visíveis e contínua. Defina a barra de escala de acordo com a configuração microscópica, desenhar uma linha em todo o processo e realizar a medição.
  4. Para analisar a continuidade do processo, selecione regiões de interesse, aplicar o filtro chamado de variação que melhora as bordas da imagem, substituindo cada pixel com sua variância vizinhança, ajustar automaticamente o contraste e brilho, contar as linhas e normalizar a contagem pela área.
  5. Calcule significância estatística usando teste t de Student de duas caudas. *, P <0,05; **, P <0,01; ***, P <0,001. Pmuito o resultado como média ± SEM.

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Resultados

Apresentamos, um sistema de baixo custo em tempo eficiente e fácil de usar para avaliar potenciais tratamentos que podem proteger contra a violação BRB induzida pela histamina. IgG é limitada dentro dos vasos na retina controle (Figura 1A), mas vaza dos vasos sanguíneos após a exposição de histamina (Figura 1B), confirmando que o modelo seja estabelecida com sucesso.

LXA4 foi escolhido para de...

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Discussão

Neste relatório, apresentamos um poderoso modelo retiniano agudo ex vivo de disfunção BRB usando a retina suína. Este sistema modelo não requer instrumentos especiais e pode ser facilmente adaptado na maioria das configurações de laboratório. No entanto, para obter um resultado bem-sucedido, várias etapas requerem muita atenção. Após a obtenção dos globos oculares da fonte, estes devem ser mantidos a 4 °C ou congelados e processados o mais rapidamente possível. Quando o efeito de um tratamento está sendo analisa...

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Divulgações

Os autores não têm nada a divulgar.

Agradecimentos

Bringhurst Meats (Berlim, NJ) é reconhecida por sua ajuda genuína em fornecer os globos oculares suínos.

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Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
DMEMLife Technologies 11965-092
HBSSLife Technologies 14170-112
SucroseJ.T.Baker4072-05
Histamina H7125-1G
Invitrogen
PFAMicroscopia Eletrônica Sciences15710
Meio de Congelamento Triangle Biomedical SciencesTFM-5
Soro de Cabra Normal RocklandD104-00-0050
Triton X-100SigmaT8787
GFAP AnticorpoMilliporeAB5804
MAP2 AnticorpoEMD MilliporeMAB3418
FITC conjugado Burro anti-coelho IgGJackson ImmunoResearch Laboratories, Inc.711-095-152
Cy3 Burro conjugado anti-rato IgGJackson ImmunoResearch Laboratories, Inc.715-165-150
meio de montagem contendo DAPIVector Laboratories, Inc.H-1200
NikonEclipse Ti microscópio
ImageJNational Institutes of Health1.45s
Penicilina-Estreptomicina  Sigma Microscópio Confocal a Laser

Referências

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