Een low-cost, is makkelijk te gebruiken en krachtige systeem opgezet om potentiële behandelingen die bloed retinale barrière schending geïnduceerd door histamine kon verbeteren evalueren. Bloedvat lekkage Müller celactivering en de continuïteit van neuronale processen worden gebruikt om de schadereactie en de omkering van een potentieel geneesmiddel, lipoxine A4 beoordelen.
A low-cost, easy-to-use and powerful model system is established to evaluate potential treatments that could ameliorate blood retinal barrier breach. An inflammatory factor, histamine, is demonstrated to compromise vessel integrity in the cultured retina through positive staining of IgG outside of the blood vessels. The effects of histamine itself and those of candidate drugs for potential treatments, such as lipoxin A4, are assessed using three parameters: blood vessel leakage via IgG immunostaining, activation of Müller cells via GFAP staining and change in neuronal dendrites through staining for MAP2. Furthermore, the layered organization of the retina allows a detailed analysis of the processes of Müller and ganglion cells, such as changes in width and continuity. While the data presented is with swine retinal culture, the system is applicable to multiple species. Thus, the model provides a reliable tool to investigate the early effects of compromised retinal vessel integrity on different cell types and also to evaluate potential drug candidates for treatment.
Een groeiende hoeveelheid bewijsmateriaal ondersteunt het bestaan van bloed retinale barrière (BRB) 1-5 en de gelijkenis met de bloed-hersenbarrière (BBB) 6,7. Compromis van de BBB is nauw verbonden causaal of diagnostische merker van chronische neurodegeneratieve ziekten zoals de ziekte van Alzheimer (AD) 8,9 en acute aandoeningen zoals delirium 10. Mechanistische inzichten in deze pathologieën en ontdekkingen voor potentiële drug targets zijn over het algemeen belemmerd door de beperkte toegankelijkheid en netwerk complexiteit van de hersenen. Alternatieven zoals in vivo beeldvorming 11, hersenen organotypische cultuur 12, primaire celculturen 13,14 en co-cultuur systemen 15 zijn gegenereerd. De meeste van deze modellen vereisen speciale instrumenten, lange experimentele perioden of meerdere markers aan cellen te identificeren. Functionele en structurele overeenkomsten tussen BBB en BRB en een correlatie tussen de DYsfunctions van de twee werden aangevoerd 16-19. Daarnaast zijn gemakkelijker toegang welomschreven celtypen en een gelaagde structuur goed gekarakteriseerde retina als een venster naar de hersenen toegestaan. De structurele en functionele identiteit van de BBB en BRB nog worden vergeleken detail. Echter, retinale aandoeningen, met name de breuk BRB, zijn ook sterk geassocieerd met de progressie van verschillende ziekten, waaronder diabetes 18-19 en AD 21,22. Derhalve is het van belang een BRB disfunctie systeem niet alleen het mechanisme af te bakenen, maar ook potentiële geneesmiddelen te screenen stellen. In dit rapport wordt een protocol waarmee BRB disfunctie met behulp van een eenvoudige acute retinale cultuur ontwikkeld en gepresenteerd.
Verhoogde BBB permeabiliteit en AD-achtige pathologische veranderingen zijn vastgesteld in de hersenen organotypische cultuur geïncubeerd met histamine, een pro-inflammatoire mediator 12. Daarom is in de gepresenteerde systeem histamine was applied de ex vivo netvlies cultuur BRB dysfunctie veroorzaken. Retina's van verschillende soorten, zoals Mus musculus pt Bos taurus, getest. Vanwege hun commerciële beschikbaarheid en gelijkenis met menselijk weefsel, werden verse varkens oogappels gebruikt om de gegevens in dit jaarverslag verschaffen. Na incubatie met histamine en / of andere geneesmiddelen werden de retina voor evaluatie verwerkt door immunokleuring voor verscheidene eiwitten 12 zoals Immunoglobuline G (IgG), een van de belangrijkste bestanddelen van het bloed; glia fibrillair zuur eiwit (GFAP), een bekend marker voor glia activering; en microtubule-geassocieerd eiwit 2 (MAP2), een neuron-specifieke cytoskelet eiwit essentieel is voor de assemblage van microtubuli. Voorts is de gelaagde structuur van het netvlies kan een gedetailleerde analyse van de processen van Müllercellen en ganglioncellen, zoals veranderingen in de breedte en continuïteit. Aldus aantal extra parameters om de gevolgen van de te evaluerenBRB breuk in een vroeg stadium en de omkering effecten van mogelijke behandelingen te evalueren.
In dit protocol wordt potentiële omkering effecten van onderzochte geneesmiddelen benaderd vanuit drie perspectieven: lekkage van bloedvaten (BV), de activering van gliacellen en de schade-reactie van neuronale cellen. Verschillende kwantificeringsmethoden worden gebruikt, bijvoorbeeld het expressieniveau getoond door de intensiteit van de immunokleuring, breedtemaat van een proces en continuïteit van neuronale uitlopers getoond door een verbetering filter. Om beter te illustreren de werkwijze en te helpen resultaten te interpreteren, lipoxine A4 (LXA4), een verbinding endogeen gesynthetiseerd in reactie op inflammatoire schade en verzachtende endotheeldysfunctie 23, is gekozen voor demonstratiedoeleinden.
In this report, we present a powerful ex vivo acute retinal model of BRB dysfunction using the swine retina. This model system does not require special instruments and can be easily adapted under most laboratory settings. However, to obtain a successful result, several steps require close attention. After obtaining the eyeballs from the source, they must be kept at 4 °C or on ice and processed as soon as possible. When the effect of a treatment is being analyzed, two halves of the same retina must be used -…
The authors have nothing to disclose.
Bringhurst Meats (Berlin, NJ) is acknowledged for their genuine help in providing the swine eyeballs.
DMEM | Life Technologies | 11965-092 | |
HBSS | Life Technologies | 14170-112 | |
Sucrose | J.T.Baker | 4072-05 | |
Histamine | Sigma | H7125-1G | |
Penicillin-Streptomycin | Invitrogen | ||
PFA | Electron Microscopy Sciences | 15710 | |
Freezing Media | Triangle Biomedical Sciences | TFM-5 | |
Normal Goat Serum | Rockland | D104-00-0050 | |
Triton X-100 | Sigma | T8787 | |
GFAP Antibody | Millipore | AB5804 | |
MAP2 Antibody | EMD Millipore | MAB3418 | |
FITC conjugated Donkey anti-rabbit IgG | Jackson ImmunoResearch Laboratories, Inc. | 711-095-152 | |
Cy3 conjugated Donkey anti-mouse IgG | Jackson ImmunoResearch Laboratories, Inc. | 715-165-150 | |
mounting medium containing DAPI | Vector Laboratories, Inc. | H-1200 | |
Laser Confocal Microscope | Nikon | Eclipse Ti microscope | |
ImageJ | National Institutes of Health | 1.45s |