एक कम लागत, करने के लिए उपयोग में आसान और शक्तिशाली प्रणाली संभावित उपचार है कि रक्त रेटिना बाधा उल्लंघन हिस्टामिन से प्रेरित उन्नति कर सकता है मूल्यांकन करने के लिए स्थापित किया गया है। रक्त वाहिका रिसाव, मुलर सेल सक्रियण और neuronal प्रक्रियाओं की निरंतरता नुकसान प्रतिक्रिया और एक संभावित दवा, lipoxin ए 4 के साथ अपने उत्क्रमण का आकलन करने के लिए उपयोग किया जाता है।
A low-cost, easy-to-use and powerful model system is established to evaluate potential treatments that could ameliorate blood retinal barrier breach. An inflammatory factor, histamine, is demonstrated to compromise vessel integrity in the cultured retina through positive staining of IgG outside of the blood vessels. The effects of histamine itself and those of candidate drugs for potential treatments, such as lipoxin A4, are assessed using three parameters: blood vessel leakage via IgG immunostaining, activation of Müller cells via GFAP staining and change in neuronal dendrites through staining for MAP2. Furthermore, the layered organization of the retina allows a detailed analysis of the processes of Müller and ganglion cells, such as changes in width and continuity. While the data presented is with swine retinal culture, the system is applicable to multiple species. Thus, the model provides a reliable tool to investigate the early effects of compromised retinal vessel integrity on different cell types and also to evaluate potential drug candidates for treatment.
सबूत के एक बढ़ती शरीर में रक्त रेटिना बाधा (BRB) 1-5 और रक्त मस्तिष्क बाधा (BBB) 6.7 करने के लिए समानता के अस्तित्व का समर्थन करता है। बीबीबी की समझौता कसकर ऐसे प्रलाप के रूप में 10 कारणतः या अल्जाइमर रोग (ई) के रूप में पुरानी neurodegenerative रोगों के लिए एक नैदानिक मार्कर के रूप में जोड़ा गया है 8,9 और गंभीर स्थिति। इन विकृतियों और संभावित दवा लक्ष्यों के लिए खोजों में यंत्रवत अंतर्दृष्टि आम तौर पर मस्तिष्क की सीमित पहुंच और नेटवर्क जटिलता के द्वारा बाधा उत्पन्न कर रहे हैं। ऐसे में vivo इमेजिंग 11, मस्तिष्क organotypic संस्कृति 12, प्राथमिक सेल संस्कृतियों 13,14 और सह-संस्कृति प्रणालियों 15 के रूप में विकल्प उत्पन्न किया गया है। हालांकि, इन मॉडलों में से सबसे कोशिकाओं की पहचान के लिए विशेष उपकरणों, लंबी अवधि के प्रयोगात्मक या एकाधिक मार्कर की आवश्यकता होती है। BBB और BRB के बीच कार्यात्मक और संरचनात्मक समानता के साथ ही वि के बीच एक संबंधदो के sfunctions 16-19 तर्क दिया गया है। इसके अलावा, आसानी से उपयोग, अच्छी तरह से परिभाषित प्रकार की कोशिकाओं और एक बहुस्तरीय संरचना मस्तिष्क के लिए एक खिड़की के रूप में अच्छी तरह से विशेषता रेटिना की अनुमति दी है। BBB और BRB के संरचनात्मक और कार्यात्मक पहचान विस्तार से तुलना करने के लिए रहते हैं। हालांकि, रेटिना विकृतियों, विशेष रूप से BRB उल्लंघन भी कसकर विभिन्न रोगों की प्रगति, मधुमेह 18-19 और ई 21,22 सहित के साथ संबद्ध किया गया है। इस प्रकार, यह एक BRB शिथिलता प्रणाली न केवल तंत्र चित्रित करने के लिए, लेकिन यह भी संभावित दवाओं स्क्रीन करने के लिए स्थापित करने के लिए ब्याज की है। इस रिपोर्ट में, एक प्रोटोकॉल को सक्षम करने BRB एक सरल तीव्र रेटिना संस्कृति का उपयोग कर रोग विकसित और प्रस्तुत किया है।
वृद्धि की बीबीबी पारगम्यता और ई-जैसे रोग परिवर्तन एक मस्तिष्क organotypic संस्कृति हिस्टामिन, एक समर्थक भड़काऊ मध्यस्थ 12 के साथ incubated में स्थापित किया गया है। इसलिए, प्रस्तुत प्रणाली में, हिस्टामिन Appl थापूर्व vivo रेटिना संस्कृति को आइईडी BRB रोग को उत्पन्न करने के लिए। ऐसे मस मस्कुलस और बोस वृषभ के रूप में कई प्रजातियों से Retinas, परीक्षण किया गया है। अपने वाणिज्यिक उपलब्धता और मानव ऊतकों को समानता के कारण, ताजा स्वाइन आंखों डेटा यहां बताया प्रदान करने के लिए उपयोग किया गया। हिस्टामिन और / या अन्य दवाओं के साथ incubating के बाद, रेटिना ऐसे इम्यूनोग्लोबिन जी (आईजीजी), रक्त के प्रमुख घटकों में से एक के रूप में कई प्रोटीन 12, के लिए immunostaining द्वारा मूल्यांकन के लिए प्रोसेस किया गया; glial fibrillary अम्लीय प्रोटीन (GFAP), glial सक्रियण के लिए एक अच्छी तरह से जाना जाता मार्कर; और microtubule जुड़े प्रोटीन 2 (MAP2), एक न्यूरॉन विशिष्ट cytoskeletal प्रोटीन microtubule विधानसभा के लिए आवश्यक है। इसके अलावा, रेटिना के स्तरित संरचना इस तरह उनकी चौड़ाई और निरंतरता में परिवर्तन के रूप में मुलर और गैंगलियन कोशिकाओं, की प्रक्रियाओं की एक विस्तृत विश्लेषण के लिए अनुमति देता है। इस प्रकार कई अतिरिक्त मापदंडों के परिणामों का आकलन करने के लिए उपलब्ध हैंएक प्रारंभिक चरण में है और साथ ही संभावित उपचार के उलट प्रभाव का मूल्यांकन करने के BRB उल्लंघन।
रक्त वाहिकाओं के रिसाव (BVS), glial कोशिकाओं की सक्रियता और neuronal कोशिकाओं की क्षति-प्रतिक्रिया: इस प्रोटोकॉल में, जांच की दवाओं के संभावित प्रभाव उलट तीन दृष्टिकोण से मूल्यांकन कर रहे हैं। कई मात्रा का ठहराव तरीकों का उपयोग किया जाता है, उदाहरण के लिए, अभिव्यक्ति के स्तर immunostaining, एक प्रक्रिया है और एक वृद्धि फिल्टर द्वारा दिखाया neuronal प्रक्रियाओं की निरंतरता की चौड़ाई माप की तीव्रता से दिखाया गया है। बेहतर तरीका वर्णन करने के लिए और मदद करने के लिए परिणामों की व्याख्या, lipoxin ए 4 (LXA4), endogenously भड़काऊ चोट के जवाब और endothelial रोग 23 attenuating में संश्लेषित एक यौगिक, प्रदर्शन प्रयोजनों के लिए चुना गया है।
In this report, we present a powerful ex vivo acute retinal model of BRB dysfunction using the swine retina. This model system does not require special instruments and can be easily adapted under most laboratory settings. However, to obtain a successful result, several steps require close attention. After obtaining the eyeballs from the source, they must be kept at 4 °C or on ice and processed as soon as possible. When the effect of a treatment is being analyzed, two halves of the same retina must be used -…
The authors have nothing to disclose.
Bringhurst Meats (Berlin, NJ) is acknowledged for their genuine help in providing the swine eyeballs.
DMEM | Life Technologies | 11965-092 | |
HBSS | Life Technologies | 14170-112 | |
Sucrose | J.T.Baker | 4072-05 | |
Histamine | Sigma | H7125-1G | |
Penicillin-Streptomycin | Invitrogen | ||
PFA | Electron Microscopy Sciences | 15710 | |
Freezing Media | Triangle Biomedical Sciences | TFM-5 | |
Normal Goat Serum | Rockland | D104-00-0050 | |
Triton X-100 | Sigma | T8787 | |
GFAP Antibody | Millipore | AB5804 | |
MAP2 Antibody | EMD Millipore | MAB3418 | |
FITC conjugated Donkey anti-rabbit IgG | Jackson ImmunoResearch Laboratories, Inc. | 711-095-152 | |
Cy3 conjugated Donkey anti-mouse IgG | Jackson ImmunoResearch Laboratories, Inc. | 715-165-150 | |
mounting medium containing DAPI | Vector Laboratories, Inc. | H-1200 | |
Laser Confocal Microscope | Nikon | Eclipse Ti microscope | |
ImageJ | National Institutes of Health | 1.45s |