Um Modelo aguda da retina para a Avaliação sanguíneos da retina barreira Descumprimento e potenciais fármacos para o tratamento
Summary
Um baixo custo, o sistema easy-to-use e poderoso é estabelecida para avaliar potenciais tratamentos que possam amenizar violação sangue barreira retina induzida pela histamina. vazamento dos vasos sanguíneos, a ativação de células Müller e a continuidade dos processos neuronais são utilizados para avaliar a resposta a danos e sua reversão com uma droga potencial, lipoxina A4.
Abstract
A low-cost, easy-to-use and powerful model system is established to evaluate potential treatments that could ameliorate blood retinal barrier breach. An inflammatory factor, histamine, is demonstrated to compromise vessel integrity in the cultured retina through positive staining of IgG outside of the blood vessels. The effects of histamine itself and those of candidate drugs for potential treatments, such as lipoxin A4, are assessed using three parameters: blood vessel leakage via IgG immunostaining, activation of Müller cells via GFAP staining and change in neuronal dendrites through staining for MAP2. Furthermore, the layered organization of the retina allows a detailed analysis of the processes of Müller and ganglion cells, such as changes in width and continuity. While the data presented is with swine retinal culture, the system is applicable to multiple species. Thus, the model provides a reliable tool to investigate the early effects of compromised retinal vessel integrity on different cell types and also to evaluate potential drug candidates for treatment.
Introduction
Um crescente corpo de evidências suportam a existência de barreira retiniana sanguínea (BRB) 1-5 e a sua semelhança com a barreira hemato-encefálica (BHE) 6,7. Compromisso da BHE foi firmemente ligado causalmente ou como um marcador diagnóstico para doenças neurodegenerativas crónicas tais como a doença de Alzheimer (AD) e 8,9 agudas condições tais como delírio 10. percepções mecanicistas para estas patologias e descobertas para alvos potenciais da droga são geralmente prejudicada pela acessibilidade e rede limitada complexidade do cérebro. Alternativas tais como imagiologia in vivo 11, cérebro cultura organotípica 12, as culturas de células primárias 13,14 e sistemas de co-cultura com 15 ter sido gerado. No entanto, a maioria destes modelos requerem instrumentos especiais, períodos experimentais longos ou múltiplos marcadores para identificar células. semelhanças estruturais e funcionais entre a certificação e BRB, bem como uma correlação entre o dysfunctions de os dois têm sido argumentado 16-19. Além disso, um acesso mais fácil, tipos celulares bem definidos e uma estrutura em camadas da retina têm permitido bem caracterizado como uma janela para o cérebro. As identidades estruturais e funcionais da BHE e BRB continuam a ser comparado em pormenor. No entanto, as patologias da retina, principalmente a quebra BRB, também foram fortemente associada com a progressão de várias doenças, incluindo a diabetes e 18-19 21,22 AD. Assim, é de interesse para estabelecer um sistema de disfunção BRB não só para delinear o mecanismo, mas também para pesquisar potenciais drogas. Neste relatório, um protocolo que permite a disfunção BRB usando uma cultura aguda de retina simples é desenvolvida e apresentada.
O aumento da permeabilidade da BHE e alterações patológicas ad como foram estabelecidas em uma cultura organotípica cérebro incubadas com histamina, um mediador pró-inflamatório 12. Portanto, no sistema apresentado, a histamina foi Applied para a cultura ex vivo para induzir disfunção da retina BRB. Retinas de várias espécies, como Mus musculus e Bos Taurus, foram testados. Devido à sua disponibilidade comercial e semelhança com o tecido humano, globos oculares suínos frescos foram utilizados para fornecer os dados aqui relatados. Após incubação com histamina e / ou outras drogas, as retinas foram processadas para avaliação por imunocoloração para várias proteínas de 12, tais como a imunoglobulina G (IgG), um dos principais componentes do sangue; proteína ácida fibrilar glial (GFAP), um marcador conhecido para a activação da glia; e proteína associada a microtúbulos 2 (MAP2), uma proteína do citoesqueleto específica para neurónios essencial para a montagem dos microtúbulos. Além disso, a estrutura em camadas da retina permite uma análise detalhada dos processos de células de Muller e células ganglionares, tais como alterações na sua largura e continuidade. Assim, vários parâmetros adicionais estão disponíveis para avaliar as consequências daBRB violação numa fase inicial e para avaliar os efeitos de reversão de potenciais tratamentos também.
Neste protocolo, os efeitos potenciais de inversão de drogas crivados são avaliadas a partir de três pontos de vista: o vazamento dos vasos sanguíneos (BVS), a activação das células da glia e os danos-resposta de células neuronais. Vários métodos de quantificação são utilizados, por exemplo, o nível de expressão mostrado pela intensidade da imunocoloração, medição da largura de um processo e de continuidade de processos neuronais mostrados por um filtro de reforço. Para melhor ilustrar o método e para ajudar a interpretar os resultados, da lipoxina A4 (LXA4), um composto sintetizado endogenamente em resposta a uma lesão inflamatória e atenuando a disfunção endotelial 23, foi escolhida para fins de demonstração.
Protocol
Representative Results
Discussion
In this report, we present a powerful ex vivo acute retinal model of BRB dysfunction using the swine retina. This model system does not require special instruments and can be easily adapted under most laboratory settings. However, to obtain a successful result, several steps require close attention. After obtaining the eyeballs from the source, they must be kept at 4 °C or on ice and processed as soon as possible. When the effect of a treatment is being analyzed, two halves of the same retina must be used -…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Bringhurst Meats (Berlin, NJ) is acknowledged for their genuine help in providing the swine eyeballs.
Materials
| DMEM | Life Technologies | 11965-092 | |
| HBSS | Life Technologies | 14170-112 | |
| Sucrose | J.T.Baker | 4072-05 | |
| Histamine | Sigma | H7125-1G | |
| Penicillin-Streptomycin | Invitrogen | ||
| PFA | Electron Microscopy Sciences | 15710 | |
| Freezing Media | Triangle Biomedical Sciences | TFM-5 | |
| Normal Goat Serum | Rockland | D104-00-0050 | |
| Triton X-100 | Sigma | T8787 | |
| GFAP Antibody | Millipore | AB5804 | |
| MAP2 Antibody | EMD Millipore | MAB3418 | |
| FITC conjugated Donkey anti-rabbit IgG | Jackson ImmunoResearch Laboratories, Inc. | 711-095-152 | |
| Cy3 conjugated Donkey anti-mouse IgG | Jackson ImmunoResearch Laboratories, Inc. | 715-165-150 | |
| mounting medium containing DAPI | Vector Laboratories, Inc. | H-1200 | |
| Laser Confocal Microscope | Nikon | Eclipse Ti microscope | |
| ImageJ | National Institutes of Health | 1.45s |
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