Острый сетчатке Модель для оценки крови сетчатке Барьерные нарушения и потенциальных лекарственных препаратов для лечения
Summary
Недорогой, простой в использовании и мощная система создана для оценки потенциальных методов лечения, которые могли бы улучшить барьерную сетчатки крови нарушение, вызванное гистамином. Утечка кровеносного сосуда, активация клеток Мюллера и непрерывность нейронных процессов используются для оценки реакции ущерба и его разворот с потенциальным препаратом, lipoxin А4.
Abstract
A low-cost, easy-to-use and powerful model system is established to evaluate potential treatments that could ameliorate blood retinal barrier breach. An inflammatory factor, histamine, is demonstrated to compromise vessel integrity in the cultured retina through positive staining of IgG outside of the blood vessels. The effects of histamine itself and those of candidate drugs for potential treatments, such as lipoxin A4, are assessed using three parameters: blood vessel leakage via IgG immunostaining, activation of Müller cells via GFAP staining and change in neuronal dendrites through staining for MAP2. Furthermore, the layered organization of the retina allows a detailed analysis of the processes of Müller and ganglion cells, such as changes in width and continuity. While the data presented is with swine retinal culture, the system is applicable to multiple species. Thus, the model provides a reliable tool to investigate the early effects of compromised retinal vessel integrity on different cell types and also to evaluate potential drug candidates for treatment.
Introduction
Все больше доказательств поддерживает существование барьера сетчатки крови (BRB) 1-5 и его сходство с гематоэнцефалического барьера (ГЭБ) 6,7. Компромисс ГЭБ была тесно связана причинной или в качестве диагностического маркера хронических нейродегенеративных заболеваний , таких как болезнь Альцгеймера (AD) 8,9 и острых состояний , таких как делирий 10. Механистические способность проникновения в суть этих патологий и открытий для потенциальных мишеней для лекарственных средств, как правило, затруднено из-за ограниченной доступности и сети запутанности мозга. Такие альтернативы, как визуализации в естественных условиях 11 мозга органотипического культуры 12 первичных культур клеток 13,14 и систем совместного культивирования 15 были сформированы. Тем не менее, большинство из этих моделей требуют специальных инструментов, длинные экспериментальные периоды или несколько маркеров для идентификации клеток. Функциональные и структурные сходства между ГЭБ и BRB, а также корреляция между Dysfunctions из двух уже утверждалось , 16-19. Кроме того, более легкий доступ, хорошо определенные типы клеток и слоистая структура позволили хорошо охарактеризованный сетчатку как окно в мозг. Структурные и функциональные тождества ВВВ и BRB остаются для сравнения в деталях. Тем не менее, патологиями сетчатки глаза, особенно нарушение BRB, также были тесно связаны с прогрессированием различных заболеваний, включая диабет и 21,22 18-19 AD. Таким образом, представляет интерес для создания системы дисфункции BRB не только очертить механизм, но и на экран потенциальных лекарств. В этом докладе, протокол позволяет BRB дисфункции, используя простой острый сетчатке культуры разработан и представлен.
Повышение проницаемости ГЭБ и AD-как патологические изменения были установлены в мозг органотипического культуры инкубировали с гистамином, провоспалительного медиатора 12. Таким образом, в представленной системы, гистамин Applс использованием СВУ культуры сетчатки экс естественных условиях , чтобы побудить BRB дисфункции. Сетчатка из нескольких видов, таких как Mus Musculus и Bos Taurus, были протестированы. Из-за их коммерческой доступности и сходством с человеческой ткани, свежие свиньи глазные яблоки использовались для предоставления данных, представленных здесь. После инкубации с гистамином и / или другими наркотиками, сетчатка были обработаны для оценки иммунным окрашиванием в течение нескольких белков 12, таких как иммуноглобулин G (IgG), один из основных компонентов крови; глиальных фибриллярный кислый белок (GFAP), хорошо известный маркер для глиальных активации; и ассоциированный с микротрубочками белок 2 (MAP2), нейрон-специфический белок цитоскелета необходимы для сборки микротрубочек. Кроме того, слоистая структура сетчатки позволяет проводить детальный анализ процессов клеток Мюллера и ганглиозных клеток, такие как изменения в их ширине и непрерывности. Таким образом, несколько дополнительных параметров можно оценить последствия решенияBRB нарушение на ранней стадии и оценить разворотные эффекты потенциальных методов лечения, а также.
В этом протоколе, потенциальные эффекты реверсирование экранированных препаратов оцениваются с трех точек зрения: утечки кровеносных сосудов (БВС), активации клеток глии и живучесть реакции нервных клеток. Существует несколько методов количественного определения используются, например, уровень экспрессии показал интенсивности иммунным, измерения ширины процесса и непрерывность нейрональных процессов, показанных с помощью фильтр улучшения. Для того, чтобы лучше проиллюстрировать метод и помочь интерпретировать результаты, lipoxin А4 (LXA4), соединение эндогенно синтезированный в ответ на воспалительные повреждения и смягчающие эндотелиальной дисфункции 23, был выбран для демонстрационных целей.
Protocol
Representative Results
Discussion
In this report, we present a powerful ex vivo acute retinal model of BRB dysfunction using the swine retina. This model system does not require special instruments and can be easily adapted under most laboratory settings. However, to obtain a successful result, several steps require close attention. After obtaining the eyeballs from the source, they must be kept at 4 °C or on ice and processed as soon as possible. When the effect of a treatment is being analyzed, two halves of the same retina must be used -…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Bringhurst Meats (Berlin, NJ) is acknowledged for their genuine help in providing the swine eyeballs.
Materials
| DMEM | Life Technologies | 11965-092 | |
| HBSS | Life Technologies | 14170-112 | |
| Sucrose | J.T.Baker | 4072-05 | |
| Histamine | Sigma | H7125-1G | |
| Penicillin-Streptomycin | Invitrogen | ||
| PFA | Electron Microscopy Sciences | 15710 | |
| Freezing Media | Triangle Biomedical Sciences | TFM-5 | |
| Normal Goat Serum | Rockland | D104-00-0050 | |
| Triton X-100 | Sigma | T8787 | |
| GFAP Antibody | Millipore | AB5804 | |
| MAP2 Antibody | EMD Millipore | MAB3418 | |
| FITC conjugated Donkey anti-rabbit IgG | Jackson ImmunoResearch Laboratories, Inc. | 711-095-152 | |
| Cy3 conjugated Donkey anti-mouse IgG | Jackson ImmunoResearch Laboratories, Inc. | 715-165-150 | |
| mounting medium containing DAPI | Vector Laboratories, Inc. | H-1200 | |
| Laser Confocal Microscope | Nikon | Eclipse Ti microscope | |
| ImageJ | National Institutes of Health | 1.45s |
Referências
- Cunha-Vaz, J., Bernardes, R., Lobo, C. Blood-retinal barrier. J Ophthalmol. 21, 3 (2011).
- Kim, J. H., et al. Blood-neural barrier: intercellular communication at glio-vascular interface. J Biochem Molec Biol. 39, 339-345 (2006).
- Kumagai, A. K. Glucose transport in brain and retina: implications in the management and complications of diabetes. Diabetes Metab Res Rev. 15, 261-273 (1999).
- Runkle, E. A., Antonetti, D. A. The blood-retinal barrier: structure and functional significance. Methods Molec Biol. 686, 133-148 (2011).
- Takata, K., Hirano, H., Kasahara, M. Transport of glucose across the blood-tissue barriers. Int Rev Cytol. 172, 1-53 (1997).
- Goncalves, A., Ambrosio, A. F., Fernandes, R. Regulation of claudins in blood-tissue barriers under physiological and pathological states. Tissue Barriers. 1, 24782 (2013).
- Patton, N., et al. Retinal image analysis: concepts, applications and potential. Prog Ret Eye Res. 25, 99-127 (2006).
- Di Marco, L. Y., et al. Vascular dysfunction in the pathogenesis of Alzheimer’s disease–A review of endothelium-mediated mechanisms and ensuing vicious circles. Neurobiol Dis. 82, 593-606 (2015).
- Nagele, R. G., et al. Brain-reactive autoantibodies prevalent in human sera increase intraneuronal amyloid-beta(1-42) deposition. J Alzheimer’s Dis: JAD. 25, 605-622 (2011).
- Goldwaser, E., Acharya, N., Nagele, R. Cerebrovascular and blood-brain barrier compromise: A mechanistic link between vascular disease and Alzheimer’s disease subtypes of neurocognitive disorders. J Parkinsons Dis Alzheimer’s Dis. 2, 10 (2015).
- Horton, N. G., et al. In vivo three-photon microscopy of subcortical structures within an intact mouse brain. Nat Photonics. 7, (2013).
- Sedeyn, J. C., et al. Histamine Induces Alzheimer’s Disease-Like Blood Brain Barrier Breach and Local Cellular Responses in Mouse Brain Organotypic Cultures. Biomed Res Int. 2015, 937148 (2015).
- Avdeef, A., Deli, M. A., Neuhaus, W., Di, L., Kerns, E. H. . Blood-Brain Barrier in Drug Discovery: Optimizing Brain Exposure of CNS Drugs and Minimizing Brain Side Effects for Peripheral Drugs. , 188 (2014).
- Eigenmann, D. E., et al. Comparative study of four immortalized human brain capillary endothelial cell lines, hCMEC/D3, hBMEC, TY10, and BB19, and optimization of culture conditions, for an in vitro blood-brain barrier model for drug permeability studies. Fluids Barriers CNS. 10, 33 (2013).
- Takeshita, Y., et al. An in vitro blood-brain barrier model combining shear stress and endothelial cell/astrocyte co-culture. J Neurosci Methods. 232, 165-172 (2014).
- Alberghina, M., Lupo, G., Anfuso, C. D., Moro, F. Palmitate transport through the blood-retina and blood-brain barrier of rat visual system during aging. Neurosci Lett. 150, 17-20 (1993).
- Hosoya, K., Yamamoto, A., Akanuma, S., Tachikawa, M. Lipophilicity and transporter influence on blood-retinal barrier permeability: a comparison with blood-brain barrier permeability. Pharm Res. 27, 2715-2724 (2010).
- Minamizono, A., Tomi, M., Hosoya, K. Inhibition of dehydroascorbic acid transport across the rat blood-retinal and -brain barriers in experimental diabetes. Biol Pharm Bull. 29, 2148-2150 (2006).
- Serlin, Y., Levy, J., Shalev, H. Vascular pathology and blood-brain barrier disruption in cognitive and psychiatric complications of type 2 diabetes mellitus. Cardiovasc Psychiatry Neurol. 2011, 609202 (2011).
- Kolb, H. How the retina works – Much of the construction of an image takes place in the retina itself through the use of specialized neural circuits. Am Sci. 91, 28-35 (2003).
- Ikram, M. K., Cheung, C. Y., Wong, T. Y., Chen, C. P. Retinal pathology as biomarker for cognitive impairment and Alzheimer’s disease. J Neurol Neurosurgery Psychiatry. 83, 917-922 (2012).
- Tan, Z., Ge, J. Amyloid-beta, the retina, and mouse models of Alzheimer disease. Am J Pathol. 176, 2055 (2010).
- Serhan, C. N. Pro-resolving lipid mediators are leads for resolution physiology. Nature. 510, 92-101 (2014).
- Bucolo, C., et al. Effects of topical indomethacin, bromfenac and nepafenac on lipopolysaccharide-induced ocular inflammation. J Pharm Pharmacol. 66, 954-960 (2014).
- Edelman, J. L., Lutz, D., Castro, M. R. Corticosteroids inhibit VEGF-induced vascular leakage in a rabbit model of blood-retinal and blood-aqueous barrier breakdown. Exp Eye Res. 80, 249-258 (2005).
