पारगमन प्रत्यारोपण माउस myeloproliferative सूजन का मॉडल
Summary
This manuscript provides a description of the methodology used to establish transduction-transplantation mouse models. A detailed account is given of technical errors to avoid when performing bone marrow transplants. A clear understanding should be gained of the importance of high viral titer, transfection/transduction, and irradiation.
Abstract
Transduction-transplantation is a quick and efficient way to model human hematologic malignancies in mice. This technique results in expression of the gene of interest in hematopoietic cells and can be used to study the gene’s role in normal and/or malignant hematopoiesis. This protocol provides a detailed description on how to perform transduction-transplantation using calreticulin (CALR) mutations recently identified in myeloproliferative neoplasm (MPN) as an example. In this protocol whole bone marrow cells from 5-flurouracil (5-FU) treated donor mice are transduced with a retrovirus encoding mutant CALR and transplanted into lethally irradiated syngeneic hosts. Donor cells expressing mutant CALR are marked with green fluorescent protein (GFP). Transplanted mice develop an MPN phenotype including elevated platelets in the peripheral blood, expansion of megakaryocytes in the bone marrow, and bone marrow fibrosis. We provide a step-by-step account of how to generate retrovirus, calculate viral titer, transduce whole bone marrow cells, and transplant into irradiated recipient mice.
Introduction
पारगमन प्रत्यारोपण चूहों में कैंसर hematologic मॉडल करने के लिए एक उपयोगी तरीका है। इस तकनीक को वापस पहला प्रदर्शन है कि बीसीआर-ABL1 के अस्थानिक अभिव्यक्ति ईमानदारी से चूहों 1 में पुरानी माइलोजेनस ल्यूकेमिया पुनरावृत्ति कर सकता है के लिए डेटिंग माइलॉयड कैंसर के अध्ययन के लिए विशेष रूप से महत्वपूर्ण हो गया है। इस तकनीक को बाद में JAK2 V617F एमपीएल और W515K / एल की व्यापक अध्ययन में मदद की है म्येलोप्रोलिफेरातिवे सूजन (MPN) उत्परिवर्तित।
एमपीएन परिपक्व माइलॉयड कोशिकाओं और अस्थि मज्जा फाइब्रोसिस के overproduction की विशेषता hematologic कैंसर का एक समूह है। इन रोगों आम तौर पर एक hematopoietic स्टेम सेल का प्रतिरूप विस्तार है कि या तो Jak2, एमपीएल, या CALR में एक दैहिक उत्परिवर्तन का अधिग्रहण किया है से उत्पन्न होती हैं। पारगमन प्रत्यारोपण JAK2 V617F एमपीएल और W515K / एल मॉडल प्रदर्शनी polycythemia वेरा और myelofibrosis 2 के नैदानिक सुविधाओं – 5 </ Sup>। हाल ही में, calreticulin-उत्परिवर्तित एमपीएन के एक माउस मॉडल भी पारगमन प्रत्यारोपण विधि 6 के साथ उत्पन्न किया गया है। इन चूहों में वृद्धि हुई प्लेटलेट्स, megakaryocytes की संख्या में वृद्धि, और अस्थि मज्जा फाइब्रोसिस के साथ एक आवश्यक thrombocythemia-तरह की बीमारी का विकास। साथ में, इन मॉडलों न केवल एमपीएन की आणविक रोगजनन में जानकारी हासिल करने का अवसर है, लेकिन यह भी विकसित करने और एक पूर्व नैदानिक सेटिंग में चिकित्सा विज्ञान का अध्ययन करने के लिए क्षमता प्रदान की है।
यह पांडुलिपि CALRdel52 उत्परिवर्तन पर ध्यान देने के साथ पारगमन प्रत्यारोपण कार्यप्रणाली का एक विस्तृत विवरण प्रदान करता है। इस तकनीक retrovirally transduced अस्थि मज्जा की कोशिकाओं उत्परिवर्ती किरणित syngeneic प्राप्तकर्ता चूहों में निर्माण व्यक्त करने का प्रत्यारोपण शामिल है।
Protocol
Representative Results
Discussion
इस प्रोटोकॉल कैसे चूहों में अस्थि मज्जा प्रत्यारोपण प्रदर्शन करने के लिए रोग के चालक के रूप में CALRdel52 उत्परिवर्तन के साथ myelofibrosis के लिए प्रगति के साथ एक आवश्यक thrombocythemia-तरह की बीमारी पुनरावृत्ति के एक विस्तृ?…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work is supported by the V Foundation Scholar (AGF) and the MPN Research Foundation (AGF).
Materials
| CELL LINES | |||
| DMEM | Corning | MT-10-013-CV | |
| 293T cells | ATCC | CRL-11268 | |
| 3T3 cells | ATCC | CRL-1658 | |
| PLASMIDS | |||
| EcoPak, also known as pCL-Eco | Addgene | 12371 | Retroviral packaging cell lines, such as EcoPack 2-293, may be used in place of the EcoPak plasmid and standard 293T cells. Additional γ-retrovirus envelope and packaging plasmids are available from Addgene and others. |
| MSCV-IRES-GFP (MIG) | Addgene | 20672 | Additional γ-retroviral transfer plasmids are available from Addgene and others. |
| CONSUMABLES | |||
| 27G x 1/2" needles | BD | 305620 | |
| Fetal bovine serum | Corning | MT-35-010-CV | |
| Penicillin/streptomycin/L-glutamine | Corning | MT-30-009-CI | |
| Trypsin-EDTA (0.05%) | Corning | MT-25-052-CI | Can be homemade |
| PBS | Corning | MT-21-031-CV | |
| 10cm dishes | Fisher | 172931 | |
| 15 ml conical tubes | Fisher | 12565268 | |
| 60mm dishes | Fisher | 150288 | |
| Polybrene | Fisher | NC9840454 | |
| 5-FU | Fisher | A13456-06 | |
| 100um cell strainers | Fisher | 22363549 | |
| 50 ml conical tubes | Fisher | 12565270 | |
| 6-well plate | Fisher | 130184 | |
| FACS tubes | Fisher | 14-959-5 | |
| 0.45um syringe filters | Fisher | 0974061B | |
| Opti-MEM | Gibco | 31985-070 | |
| ACK buffer | Lonza | 10-548E | Can be homemade |
| Recombinant murine IL-3 | Peprotech | 213-13 | |
| Recombinant murine IL-6 | Peprotech | 216-16 | |
| Recombinant murine SCF | Peprotech | 250-03 | |
| X-tremeGENE 9 | Roche | 6365809001 | Transfection reagent |
| 1.5 ml centrifuge tubes | USA Scientific | 1615-5500 | |
| EQUIPMENT | |||
| BD Accuri C6 | |||
| X-ray irradiator |
Referências
- Daley, G. Q., Van Etten, R. A., Baltimore, D. Induction of chronic myelogenous leukemia in mice by the P210bcr/abl gene of the Philadelphia chromosome. Science(New York, N.Y.). 247 (4944), 824-830 (1990).
- Wernig, G., Mercher, T., Okabe, R., Levine, R. L., Lee, B. H., Gilliland, D. G. Expression of Jak2V617F causes a polycythemia vera-like disease with associated myelofibrosis in a murine bone marrow transplant model. Blood. 107 (11), 4274-4281 (2006).
- Lacout, C., Pisani, D. F., Tulliez, M., Gachelin, F. M., Vainchenker, W., Villeval, J. L. JAK2V617F expression in murine hematopoietic cells leads to MPD mimicking human PV with secondary myelofibrosis. Blood. 108 (5), 1652-1660 (2006).
- Zaleskas, V. M., Krause, D. S., et al. Molecular pathogenesis and therapy of polycythemia induced in mice by JAK2 V617F. PloS One. 1, e18 (2006).
- Bumm, T. G. P., Elsea, C., et al. Characterization of murine JAK2V617F-positive myeloproliferative disease. Cancer Res. 66 (23), 11156-11165 (2006).
- Marty, C., Pecquet, C., et al. . Calreticulin mutants in mice induce an MPL-dependent thrombocytosis with frequent progression to myelofibrosis. , (2015).
- Klampfl, T., Gisslinger, H., et al. Somatic mutations of calreticulin in myeloproliferative neoplasms. N. Engl. J. Med. 369 (25), 2379-2390 (2013).
- Araki, M., Yang, Y., et al. Activation of the thrombopoietin receptor by mutant calreticulin in CALR-mutant myeloproliferative neoplasms. Blood. , (2016).
- Limón, A., Briones, J., et al. High-Titer Retroviral Vectors Containing the Enhanced Green Fluorescent Protein Gene for Efficient Expression in Hematopoietic Cells. Blood. 90 (9), 3316-3321 (1997).
- Duran-Struuck, R., Dysko, R. C. Principles of bone marrow transplantation (BMT): providing optimal veterinary and husbandry care to irradiated mice in BMT studies. J. Am. Assoc. Lab. Anim. Sci. 48 (1), 11-22 (2009).
- Gavrilescu, L. C., Van Etten, R. A. Production of Replication-Defective Retrovirus by Transient Transfection of 293T cells. J. Vis. Exp. (10), (2007).
- Challen, G. A., Boles, N., Lin, K. K., Goodell, M. A. Mouse Hematopoietic Stem Cell Identification And Analysis. Cytometry A. 75 (1), 14-24 (2009).
- Ergen, A. V., Jeong, M., Lin, K. K., Challen, G. A., Goodell, M. A. Isolation and characterization of mouse side population cells. Methods Mol. Bio. (Clifton, N.J.). 946, 151-162 (2013).
- Weksberg, D. C., Chambers, S. M., Boles, N. C., Goodell, M. A. CD150- side population cells represent a functionally distinct population of long-term hematopoietic stem cells. Blood. 111 (4), 2444-2451 (2008).
- Oguro, H., Ding, L., Morrison, S. J. SLAM family markers resolve functionally distinct subpopulations of hematopoietic stem cells and multipotent progenitors. Cell Stem Cell. 13 (1), 102-116 (2013).
- Li, J., Kent, D. G., Chen, E., Green, A. R. Mouse models of myeloproliferative neoplasms: JAK of all grades. Dis. Model. Mech. 4 (3), 311-317 (2011).
- Mullally, A., Lane, S. W., Brumme, K., Ebert, B. L. Myeloproliferative neoplasm animal models. Hematol. Oncol. Clin. North Am. 26 (5), 1065-1081 (2012).
