Aqui demonstramos como induzir e monitorar a regeneração na anêmona-do-mar Nematostella vectensis, um modelo de antozoário cnidário. Demonstramos como amputar e categorizar a regeneração usando um sistema de estadiamento morfológico e usamos esse sistema para revelar um requisito de autofagia na regeneração de estruturas de pólipos.
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Artigo de método
Induzindo completa Polyp Regeneração do aboral Physa da Anémona Starlet Vectensis Nematostella
Neste artigo
Resumo
Resumo
Cnidários e, especificamente, Hydra, foram os primeiros animais indicado para regenerar estruturas danificadas ou cortada, e na verdade esses estudos sem dúvida lançados investigação biológica moderna através do trabalho de Trembley mais de 250 anos atrás. Presentemente o estudo de regeneração tenha visto um ressurgimento usando ambos os organismos regenerativos "clássicas", tais como a hidra, e Planaria Urodelos, bem como um alargamento do espectro de espécies que abrangem a gama de metazoários, a partir de esponjas através de mamíferos. Além de seu interesse intrínseco como um fenômeno biológico, a compreensão de como a regeneração funciona em uma variedade de espécies irá informar-nos sobre se a processos regenerativos compartilhar recursos e / ou espécies comuns ou mecanismos celulares e moleculares específicas ao contexto. A anêmona de mar estrela, Nematostella vectensis, é um organismo modelo emergente para a regeneração. Como Hydra, Nematostella é membro do filo antiga, cnidaria, mas dentro de tele anthozoa classe, um clado irmão do Hydrozoa que é evolutivamente mais basal. Assim, os aspectos da regeneração na Nematostella será interessante comparar e contrastar com os de Hydra e outros cnidários. Neste artigo, apresentamos um método para bissetriz, observar e classificar a regeneração do fim aboral do adulto Nematostella, que é chamado de physa. O physa naturalmente sofre fissão como um meio de reprodução assexuada, e quer fissão naturais ou amputação manual da physa desencadeia re-crescimento e reforma de morfologias complexas. Aqui temos codificada estas alterações morfológicas simples em um sistema de estadiamento Nematostella Regeneração (a ENSR). Usamos o NRSS para testar os efeitos de cloroquina, um inibidor da função lisossómica que bloqueia autofagia. Os resultados mostram que a regeneração de estruturas de pólipos, particularmente os mesentério, é anormal quando autofagia é inibida.
Introdução
A observação de regeneração em um único hidra foi o evento seminal na advento da biologia como um 1,2 ciência experimental. Regeneração continua a ser um fenômeno da extraordinariamente amplo apelo para biólogo e leigo alike. O potencial para os biólogos do desenvolvimento, médicos, cientistas biomédicos e engenheiros de tecido para entender e superar os limites sobre a regeneração humana faz biologia regeneração mais de intrinsecamente interessante.
Agora, com o uso de tecnologias emergentes, como a sequenciação do genoma e ganho e perda de ferramentas de função, o campo está pronta para provocar mecanismos além regen....
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Protocolo
1. Condicionado dos Animais para temperatura, Nutrição e ciclo claro / escuro
- Obter adultos Nematostella vectensis de um dos numerosos laboratórios Nematostella em todo o mundo, ou um fornecedor sem fins lucrativos (Tabela 1)
- Manter Nematostella a uma temperatura constante (tipicamente entre 18 e 21 ° C) no escuro, em "1 / 3x" mar artificial água (ASW) a uma salinidade de 12 partes por mil (ppt). Manter culturas simples de soda-cal placas de cultura de vidro, tipicamente 250 mL ou 1,5 L de capacidade 11.
Nota: Estas condições de cultura simples são comumente usado entre os laboratórios....
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Resultados
A progressão de eventos morfológicas durante a regeneração em physa cortada é mostrado na Figura 1A, que inclui vistas representativas de physa em cada fase NRSS. O site típico physa corte é indicado no adulto (setas). As fotografias na Figura 1A mostra a regeneração progressiva das estruturas orais e corporais a partir physa recém-cortada através pólipo completamente formado. Figura 1B, C mostram a disposição dos septos internos, os mes.......
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Discussão
Uso de Nematostella como um modelo de cura de feridas e a regeneração está a tornar-se cada vez mais popular. Assim, é importante ser capaz de visualizar os padrões morfológicos de um protocolo em particular antes de análises celulares e moleculares eficazes podem ser atribuídas e comparados. Nematostella têm um elevado grau de "flexibilidade" regenerativa, ser capaz de mudar a quase qualquer estrutura que falta amputado em qualquer local, em fases pós-Planula de vida. Assim, vários investiga.......
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Divulgações
Os autores não têm nada a divulgar.
Agradecimentos
Este trabalho foi apoiado por uma Stem Cell New York Science (NYSTEM C028107) Grant para GHT.
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Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| Nematostella vectensis, adultos | Marine Biological Lab (MBL) | fornecedor sem fins lucrativos Prato de | |
| cultura de vidro, 250 mL | Carolina Biological Supply | 741004 | 250 mL |
| Prato de cultura de vidro, 1.500 mL | Carolina Biological Supply | 741006 | 1.500 mL |
| Pipeta de transferência de polietileno, 5 mL | USA Scientific | 1022-2500 | furo estreito, |
| pipeta de transferência de polietileno graduado, cônico | Samco | 202-205 | cortou 1 polegada de ponta para fazer furo largo |
| Navalha de segurança de penas | bisturi descartável | no. 10 | lâmina deve ser curvada |
| # 5 Dumont Pinças de ponta fina | Roboz | RS5045 | fornecedores alternativos disponíveis |
| Placa de Petri Pyrex, 100 mm de diâmetro | Corning | 3160 | pode substituir outras placas de vidro Petri |
| Placa estéril de 6 poços | Corning Falcon | 353046 | ou similar de outro fabricante |
| Placa estéril de 12 poços | Nunc | 150628 | ou similar de outro fabricante |
| Placa estéril de 24 poços | Cellstar, Greiner bio-one | 662-160 | ou similar de outro fabricante |
| Kit de camarão em salmoura | Baía de São Francisco; drsfostersmith.com | CD-154005 | opção para o cultivo de camarão em salmoura |
| de pirex | comum em supermercados | opção para o cultivo de artêmia | |
| Mistura Artificial de Água do Mar 50 Gal ou Mais | Instant Ocean; drsfoster-smith.com | CD-116528 | outras marcas podem ser suficientes |
| Banheira de plástico para estoque Preparação ASW | várias | latas de lixo de plástico comuns de 25 galões OK | |
| Polipropileno Carboy | Carolina Biological Supply | 716391 | Para estoque de trabalho de ASW @ 12 ppt |
| Beaker, Graduado, 4.000 mL | PhytoTechnology Laboratories | B199 | Para diluição de 36 ppt ASW para 12 ppt |
| Estereomicroscópio e fonte de luz | vários | com ampliação contínua de 1 a 40X |
Referências
- Lenhoff, S. G., Lenhoff, H. M. Hydra and the Birth of Experimental Biology: Abraham Trembley's Memoirs Concerning the Natural History of a Type of Freshwater Polyp with Arms Shaped like Horns. , The Boxwood Press. (1986).
- Trembley, A.
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Reimpressões e permissões
