Different levels and patterns of fluid shear are known to modulate endothelial gene expression, phenotype and susceptibility to disease. We discuss the assembly and use of ‘shear rings’: a model that produces unidirectional, periodic shear stress patterns. Shear rings are simple to assemble, economical and can produce high cell yields.
Afwijkingen van normale niveaus en patronen van vasculaire vloeistof shear spelen een belangrijke rol in vasculaire fysiologie en pathofysiologie door inductie adaptieve en pathologische veranderingen in endotheliale fenotype en genexpressie. In het bijzonder kan maladaptive effecten van periodieke unidirectionele stroming veroorzaakte afschuifspanning diverse effecten op vasculaire verschillende celtypes, met name endotheelcellen activeren. Hoewel inmiddels endotheelcellen van verschillende anatomische afkomst zijn gekweekt, diepgaande analyses van hun antwoorden op vloeistof shear werden gehinderd door de relatieve complexiteit van de shear modellen (bijvoorbeeld parallelle plaat stroom kamer, kegel en plaat flow model). Hoewel deze allemaal uitstekend benaderingen vertegenwoordigen dergelijke modellen technisch ingewikkeld en lijden aan nadelen waaronder relatief lange en ingewikkelde insteltijd, geringe oppervlak eisen voor pompen en druk brengen waarvoor vaak afdichtingsmiddelen en pakkingen, waardoor uitdagingen both steriliteit te handhaven en een onvermogen om meerdere experimenten uitgevoerd. Wanneer hogere doorvoersnelheid modellen van stroming en afschuiving beschikbaar, meer vooruitgang op vasculaire endotheliale shear reacties waren bijzonder periodieke afschuiving onderzoek op moleculair niveau, kan sneller gevorderd zijn. Hier beschrijven we de bouw en het gebruik van de shear ringen: een nieuwe, eenvoudig te monteren, en goedkope weefselkweek model met een relatief groot oppervlak dat gemakkelijk zorgt voor een hoog aantal experimentele herhalingen in één richting, periodieke shear stress studies over endotheel cellen.
Vloeistof shear stress is aangetoond dat endotheelcellen gen moduleren's 1-5 door activatie van cis-regulerende elementen 6, histone acetyltransferase-activiteit 7 en schuifspanning respons elementen (SSRE) 8. Afschuifspanning invloeden endotheliale bijdragen voor coagulatie door het moduleren weefselfactor 9 en weefselplasminogeenactivator (tPA) 10 expressie. Shear stress beïnvloedt ook de controle van angiogenese 11 en vat remodeling door het reguleren van PDGF-B-synthese en het reactievermogen 8. Het endotheel afgeleide vasoactieve mediatoren adrenomedullin, endotheline-1, urotensine II en relaxin worden ook geregeld door afschuiving 12. Transcriptie van endotheel stikstofoxide synthase productie en de productie van stikstofoxide zijn beide shear afhankelijk 10. Shear controleert ook endotheliale ICAM-1-expressie 13. Stromingsgeïnduceerde shear stress kan dus powerfully kracht een grote verscheidenheid aan endotheliale responsen. Belangrijker vasculaire pulsaties nu ook blijken belangrijke rol spelen in de pathofysiologie van zowel normale vasculaire veroudering en vormen van vasculaire dementie 14 en kan zelfs bijdragen aan andere neurodegeneratieve ziekten, zoals multiple sclerose 15.
Veneuze en arteriële endotheelcellen inherent blootgesteld aan diverse hemodynamische stromingspatronen in vivo, en veel verschillende endotheelcellen fenotypes kunnen worden tentoongesteld 16. Afhankelijk van de grootte en frequentie van stroming, kan effecten op endotheliale cellen omvatten ontstekingscellen activering en apoptose, die veranderingen in gen of eiwitexpressie 17,18 kunnen weerspiegelen. Studies op endotheliale celreacties op verschijnselen blijft derhalve gecompliceerd door de moeilijkheden afschuiven vervaardiging van in vitro modellen die adequaat produceren dergelijke afschuiving patronen.
Veel verschillende experimental protocollen ontwikkeld om vloeistof schuifspanning toepassing op endotheliale celmonolagen. Een van de meest gebruikte systemen is de parallelle plaat stroming kamer, die gelijkmatige laminaire stroming binnen de kamer 19 creëert – 21. Een peristaltische pomp is typisch verbonden met periodieke stroom, die stromingseigenschappen kenmerkend voor vele locaties in vivo 22 kan herhalen maken. Een andere gemeenschappelijke opstelling gebruikt het 'kegel en plaat-model, waarbij fluïdum afschuifspanning wordt bepaald door de rotatiesnelheid van de conus 23. Beide systemen, en andere soortgelijke regelingen hen kan vervelend zijn voor het opzetten en vereisen componenten die relatief duur en ontoegankelijk voor veel laboratoria kunnen worden.
Een andere belangrijke beperking van deze huidige modellen is het relatief lage aantal gelijke studies die gelijktijdig kunnen worden uitgevoerd, elk met een relatief klein oppervlak. Dit verhoogt de tijd en co mplexity van deze aanpak. Daarom zou een ideaal model unidirectionele en periodieke shear induceert een waar een groot aantal studie duplo eenvoudig worden ingesteld, elk met een relatief groot oppervlak. Bovendien, de eerder genoemde modellen vereisen een vrij geavanceerde setup, die kosten prohibitief kan zijn voor veel gebruikers. Een model dat shear verstoringen vloeistof kan produceren met behulp van elementaire laboratorium materialen kan enkele voordelen hebben.
Een eenvoudige en zeer voordelige wijze van aanbrengen unidirectionele periodieke afschuifspanning omvat het plaatsen van cirkelvormige schotels op een rondschudapparaat 24. Dit protocol is zeer eenvoudig en kan worden opgeschaald naar grote aantallen studie gerepliceerd, elk met een betrekkelijk groot oppervlak te bereiken, indien nodig. Cellen in het midden van de schaal worden blootgesteld aan verschillende stromingspatronen dan cellen langs de omtrek, waarbij gemengde cellulaire fenotypische responsen in dezelfde schotel.
_content "> In dit huidige rapport beschrijven we de bouw en het gebruik van 'shear ringen', ons model voor het creëren van één richting en periodieke shear stress. Het ontwerp voor de shear ring effectief 'mixed' cellulaire afschuiving geïnduceerde fenotypes grenzen door de stroming te beperken route in een cirkelvormige kweekschaal aan de omtrek door de plaatsing van een binnenring. de constructie en werking van de afschuifring eenvoudig en goedkoop en kan eenvoudig worden aangepast aan een breed scala van orbitale shakers geschikt gebruik van algemeen beschikbare weefselkweek voorraden. Deze model kan in endotheelcellen experimenten worden toegepast op één richting en periodieke stromingspatronen te bieden binnen de fysiologische en pathofysiologische niveaus.De constructie van de afschuiving ringsysteem voor het belichten endotheelcellen afschuiving is een eenvoudige benadering van het uitvoeren afschuifspanning studies. Toch zijn er enkele stappen die essentieel zijn voor het verkrijgen van superieure afschuiving ringen en betere resultaten. Een volledige afdichting moet worden gemaakt tussen de binnenste en buitenste ring om de media te voorkomen dat lekken die in strijd zijn shear stress onder samples zou kunnen leiden. Als een volledige afdichting uitblijft, slechts een…
The authors have nothing to disclose.
De auteurs willen graag de hulp van de heer Christopher Nguyen, Aaron Hunter en de Shreveport Jumpstart, SMART, en biostart opleidingen evenals de Centenary College of Louisiana afdeling Biofysica, Shreveport, LA erkennen.
100 x 20 mm plastic tissue culture dish | Corning | 430167 | The dishes must be polystyrene |
150 x 25 mm plastic tissue culture dish | Corning | 430599 | The dishes must be polystyrene |
150 mm glass petri dish | Fisher | 3160150BO | |
15ml polystyrene tissue culture plastic tubes | Falcon | 352099 | |
Methylene chloride | Sigma-Aldrich | D65100 | |
silicone rubber sealant | DAP | 7079808641 | |
ethanol | Decon | 2701 | |
3 mL transfer pipette | Becton-Dickinson | 357524 | |
printer paper | |||
scissors | |||
gloves | |||
rotary tool and set | Dremel | 4000-6/50 | |
rotary tool cutting head | Dremel | EZ476 | |
rotary tool drill head | |||
distilled water | |||
orbital shaker | VWR | 57018-754 | |
incubator | |||
Rat retinal microvascular endothelial cells | Cell Biologics | RA-6065 |