Флуоресцентным на основе анализа фосфолипида Scramblase деятельности

Summary

We describe a fluorescence-based assay to measure phospholipid scrambling in large unilamellar liposomes reconstituted with opsin.

Abstract

Scramblases транслокации фосфолипидов поперек мембраны бислой двунаправленным в АТФ-независимым способом. Первый scramblase быть идентифицированы и проверены биохимически был Opsin, апопротеина фоторецептора родопсина. Родопсин является G-белком рецептор локализован в стержень фоторецепторов дисковые мембраны сетчатки, где он отвечает за восприятие света. Scramblase деятельность родопсина не зависит от его лиганда 11- цис – -retinal, т.е. апопротеинового опсина также активен как scramblase. Хотя конститутивный и регулируется фосфолипид скремблирования играют важную роль в клеточной физиологии, лишь несколько фосфолипидов scramblases были определены до сих пор, кроме опсином. Здесь мы опишем флуоресцентного анализа на основе из scramblase активности Opsin в. Opsin восстанавливали в большие однослойные липосомы, состоящие из фосфатидилхолина, фосфатидилглицерина и следовые количества флуоресцентного НБД-меченых ПК (1-рalmitoyl-2- {6- [7-нитро-2-1,3-benzoxadiazole-4-ил) амино] гексаноил} – зп глицеро-3-фосфохолин). Scramblase активность определяют путем измерения степени, в которой молекулы НБД-PC, расположенные во внутреннем листке везикулы способны получить доступ к наружной листовку, где их флуоресценции химически устранен с помощью восстанавливающего агента, который не может пересекать мембрану. Методы, описанные нами находит широкое применение и могут быть использованы для идентификации и характеристики scramblase деятельности других мембранных белков.

Introduction

Фоторецепторов родопсин, прототипическим G-белком рецептор (рассмотрен, например , в ссылке ^1), является первым фосфолипид scramblase быть идентифицированы и биохимически проверено ^2,3. Scramblases являются фосфолипидов транспортеров , которые увеличивают внутренне медленную скорость transbilayer фосфолипидов движения физиологически соответствующих уровней в двунаправленной, АТФ-независимым способом ^4-6. Примерами их действий могут быть найдены в эндоплазматический ретикулум и бактериальной цитоплазматической мембраны , где конститутивным скремблирования необходим для мембранного гомеостаза и роста, а также для различных путей гликозилирования ^5. Регулируемый фосфолипид скремблирование необходимо подвергать фосфатидилсерина (PS) на поверхности апоптотических клеток , где он действует как "съесть-меня" -сигнала для макрофагов ⁷ и обеспечивает поверхность прокоагулянтную на активированных тромбоцитах , чтобы катализировать образование фактора белкаы необходимы для свертывания крови. В фоторецепторов дисковых мембран, карабкаясь активность родопсина была предложено , чтобы противодействовать фосфолипидов дисбаланс между двумя мембранами листков бислоя , который генерируется АТФ-зависимый, однонаправленного липида флиппазы abca4 ^{4,8,9 10-12.}

Несмотря на Физиологическое значение scramblases, их идентичность остаются неясными до родопсина не сообщалось как scramblase в фоторецепторных дисков ^2, были идентифицированы членами семейства белков TMEM16 , как Са ²⁺ -зависимые scramblases , необходимые для облучения PS в плазматической мембране (обзор в ссылке ^13), и бактериальный белок FtsW был предложен как липид II scramblase требуется для синтеза пептидогликана ^14. Эти открытия были основаны на восстановлении очищенных белков в липосомы и демонстрации scramblase активности в результате протеолипосом с использованием методологии describред здесь. Другие потенциальные scramblases ^15-21 – эти белки MurJ и Amj замешанные в пептидогликана биосинтеза, WzxE и родственные белки участвуют в скремблирования O-антиген предшественников, ФЗПНМ белков необходимо для транслоцироваться аминоацилирована фосфатидилглицерин через цитоплазматическую мембрану бактериальной, и члены семьи Xkr8 , которые были предложены выставить PS на поверхности апоптотических клеток – остаются для тестирования биохимически. Это подчеркивает важность надежного анализа, чтобы определить и охарактеризовать scramblase активность.

Здесь мы описываем воссоздание очищенного опсином, апопротеина фоторецептора родопсина, в большие однослойные везикулы (БУВ), и последующий анализ scramblase активности в результате протеолипосом с использованием флуоресцентного анализа на основе. Есть несколько хорошо описанных протоколов, доступных в литературе для гетерологичной экспрессии и очистки опсином, поэтому мы не будемописать его в этом протоколе; мы используем протоколов , описанных в Горен и др. ³ , который дает ФЛАГ-меченый, термостабильный опсина при температуре около 100 нг / мкл в 0,1% (вес / объем) dodecylmaltoside (ДДМ).

Разбавление достигается путем обработки БУВ с достаточным моющим средством таким образом, что они набухают, но не растворяются. В этих условиях, мембранный белок – поставляется в виде белково-детергентных мицелл – интегрирует в липосомы и стать восстанавливали в липосомальной мембраны при удалении моющего средства, в результате чего протеолипосомах. Для того, чтобы восстановить опсином (полученный в виде очищенного белка в 0,1% (вес / об) DDM), БУВ получают из смеси РОРС (1-пальмитоил-2-oleoyl- зп глицеро-3-фосфохолин) и POPG (1- пальмитоил-2-oleoyl- зп глицеро-3- [фосфо-рац- (1-глицерин)]) и насыщали DDM перед добавлением опсином и NBD-PC. Моющее средство удаляют путем обработки образца с полистирольных шариков.

<p c деваха = "jove_content"> Принцип , лежащий в основе флуоресцентного анализа на основе показана на рисунке 1В. БУВ симметрично разведен с помощью микроскопического количества NBD-PC или другого НБД-меченого флуоресцентной фосфолипидного репортера (Рис . 1А) При добавлении дитионита, мембраносвязанным impermeant дианион, молекулы НБД-ПК в наружном листке БУВ оказываются нефлуоресцирующего как нитро-группой NBD сводится к нефлуоресцентном амино-группы. Поскольку ни молекулы НБД-PC, ни дитионит способны проходить через мембрану, на временной шкале эксперимента (<10 мин), это приводит к уменьшению на 50 флуоресцентного сигнала%. Тем не менее, если липосомы разведен с помощью scramblase, молекулы НБД-ПК во внутреннем листке может быстро вскарабкаться к внешней стороне, где они уменьшаются. Это приводит к полной потере флуоресценции в идеальном случае (рис 1C).

эс / ftp_upload / 54635 / 54635fig1.jpg "/>
. Рисунок 1: Схематическое изображение анализа scramblase активности Анализ используется люминесцентная NBD-меченых репортер липида; НБД-ПК показан (А). Большие однослойные везикулы восстанавливали микроскопического количества NBD-PC. Разбавление производит симметричные везикул, с НБД-PC распределенной равномерно во внешних и внутренних листков. Дитионит (S ₂ O ₄ ^2-) химически уменьшает нитро-группу NBD к нефлуоресцентном амино-группы. Лечение безбелковых липосом с дитионита (B, вверху) приводит к снижению на 50% от флуоресценции , так как только молекулы НБД-ПК в наружной листовке снижаются: дитионит отрицательно заряженными и не могут пересекать мембрану , чтобы вступать в реакцию с молекулами НБД-PC во внутреннем листке. Дитионит лечение Opsin содержащих протеолипосом (B, внизу), т.е. scramblase-активных протеолипосомы, приводит к 100% потере еluorescence, как опсином облегчает перемещение НБД-PC между внутренним и наружным листком. (С) показывает идеализированные флуоресценции следы , полученные на лечении небелковых липосом и Opsin содержащих Протеолипосомы с дитионита. Скорость потери флуоресцентной одинакова в обоих случаях, указывающих, что химическое восстановление NBD дитионитом является ограничивающим скорость, и что скремблирования происходит со скоростью, равной или большей, чем скорость химической реакции. Следы , полученные от фактического эксперимента показаны на рисунке 3. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.

Методы , описанные нами могут быть использованы для восстановления и пробирного другие очищенные белки, а также их смеси мембранных белков , полученных, например, путем экстракции микросом с помощью моющих средств ^22.

Protocol

1. Получение липосом, и протеолипосомах липосом Формирование С помощью стеклянного шприца, добавьте 1,435 мкл POPC (25 мг / мл, в хлороформе) и 160 мкл POPG (25 мг / мл, в хлороформе), в круглодонную колбу, чтобы получить 52,5 мкмоль липидов в мольном соотношении РОРС: POPG = 9: 1. Сухие липиды …

Representative Results

Описано воссоздание опсином в БУВ охарактеризовать его scramblase активности с использованием флуоресцентного анализа на основе. Анализируются результаты поместить нижний предел скорости опсина-опосредованной фосфолипида скремблирования и для определения олигомерно?…

Discussion

Анализ scramblase активности позволил нам изначально определить , что опсина обладает фосфолипидов scramblase активностью ^2. Анализ также позволил нам охарактеризовать scramblase активность Opsin путем тестирования специфичности (мы использовали различные НБД-меченых репортер липидов , таких к?…

Materials

1-palmitoyl-2-oleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine	Avanti Polar Lipids	850457C	POPC
1-Palmitoyl-2-oleoyl-sn-glycero-3-phospho-rac-(1-glycerol) (sodium salt)	Avanti Polar Lipids	840457C	POPG
1-palmitoyl-2-{6-[7-nitro-2-1,3-benzoxadiazol-4-yl)amino]hexanoyl}-an-glycero-3-phosphocholine	Avanti Polar Lipids	810130C	NBD-PC
4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid	VWR Scientific	EM-5330	HEPES
NaCl	Sigma	S7653-1KG	NaCl
Dodecyl-β-d-maltoside	Anatrace	D310 5 GM	DDM
Fluorimeter cuvettes	sigma	C0918-100EA	cuvettes
Spectrofluorometer	Photon Technology International, Inc.		fluorimeter
Sodium hydrosulfite technical grade, 85%	Sigma	157953-5G	dithionite
GraphPad Prism 5 software			Prism
Tris Base	VWR	JTX171-3	Tris
LIPEX 10 mL extruder	Northern Lipids, Inc.		Extruder
Whatman, Drain disc, PE, 25 mm	Sigma	28156-243	Disc support
Whatman Nuclepore Track-Etched Membranes, 0.4 µm, 25 mm diameter	Sigma	WHA110607	400 nm membrane
Whatman Nucleopore Track-Etched Membranes, 0.2 µm, 25 mm diameter	Sigma	WHA110606	200 nm membrane
sodium phosphate	Sigma	S3264-500G
VWR Culture Tubes, Disposable, Borosilicate Glass, 13×100 mm	VWR Scientific	47729-572	glass tubes
Perchloric acid	Sigma	30755-500ML
Ammonium Molybdate Tetrahydrate	Sigma	A-7302	ammonium molybdate
(+)-Sodium L-ascorbate	Sigma	A7631-25G	sodium ascorbate
Bio-Beads SM2 adsorbents	Bio Rad	1523920	polystyrene beads
2.0 mL Microtubes clear	VWR Scientific	10011-742	Reconstitution tubes
Reconstitution glass tube	VWR Scientific	53283-800	Reconstitution glass tubes
Zetasizer	Malvern		DLS