En fluorescensbaserad analys av Phospholipid Scramblase Aktivitet

Summary

We describe a fluorescence-based assay to measure phospholipid scrambling in large unilamellar liposomes reconstituted with opsin.

Abstract

Scramblases translokerar fosfolipider över membranbiskiktet båda riktningarna i en ATP-oberoende sätt. Den första scramblase identifieras och biokemiskt verifieras var opsin, apoproteinet av ljusmätare rhodopsin. Rhodopsin är en G-proteinkopplad receptor lokaliserad i stavfotoreceptorskivmembran hos näthinnan där det är ansvarig för uppfattningen av ljus. Rhodopsin s scramblase aktivitet beror inte på dess ligand 11- cis -retinal, dvs är apoprotein opsin också verksam som scramblase. Även konstitutiv och reglerad fosfolipid förvränga spela en viktig roll i cellfysiologi, har endast ett fåtal fosfolipid scramblases hittills identifierats förutom opsin. Här beskriver vi en fluorescensbaserad analys av opsin s scramblase aktivitet. Opsin bereds i stora unilamellära liposomer sammansatta av fosfatidylkolin, fosfatidylglycerol och en spårmängd av fluorescerande NBD-märkt PC (1-palmitoyl-2- {6- [7-nitro-2-1,3-bensoxadiazol-4-yl) amino] hexanoyl} – sn-glycero-3-fosfokolin). Scramblase aktivitet bestäms genom att mäta i vilken utsträckning NBD-PC-molekyler som finns i den inre bipacksedel vesikeln kan komma åt den yttre broschyr där deras fluorescens kemiskt elimineras genom ett reduktionsmedel som inte kan passera membranet. De metoder som vi beskriver har allmän tillämpbarhet och kan användas för att identifiera och karakterisera scramblase verksamheten i andra membranproteiner.

Introduction

Fotoreceptorn rhodopsin, en prototypisk G-proteinkopplade receptorer (översikt exempelvis i referens ^1), är den första fosfolipid scramblase identifieras och biokemiskt verifierade ^2,3. Scramblases är fosfolipid transportörer som ökar i sig långsam transbilayer fosfolipid rörelse för att fysiologiskt lämpliga nivåer i en dubbelriktad, ATP-oberoende sätt ^4-6. Exempel av sina handlingar kan hittas i det endoplasmatiska nätverket och bakteriell cytoplasmiska membranet där det behövs för membran homeostas och tillväxt konstitutiv klättra, liksom för en rad olika glykosylering vägar ^5. Regleras fosfolipid behövs kodning för att exponera fosfatidylserin (PS) på ytan av apoptotiska celler där den verkar som en "äta-me" -signal för makrofager ⁷ och ger en prokoagulerande yta på aktiverade blodplättar för att katalysera produktionen av proteinfaktors behövs för blodproppar. I ljusmätare skivmembran har rhodopsin s förvrängnings aktivitet föreslagits för att motverka den fosfolipid obalansen mellan de två membran broschyrer av dubbelskiktet som genereras av den ATP-beroende, ensriktad lipid Flippase ABCA4 ^{4,8,9 10-12.}

Trots den fysiologiska betydelsen av scramblases förblev sin identitet svårfångade tills rhodopsin rapporterades som en scramblase i ljusmätare skivor ^två medlemmar av TMEM16 proteinfamiljen identifierades som Ca2 ⁺ -beroende scramblases behövs för PS exponeringen vid plasmamembranet (ses med hänvisning ^13), och den bakteriella proteinet FtsW föreslogs som en lipid II scramblase krävs för peptidoglykansyntesen ^14. Dessa upptäckter baserades på beredning av renade proteiner i liposomer och demonstration av scramblase aktivitet i de resulterande proteoliposomer hjälp av den metod described här. Andra potentiella scramblases ^15-21 – de MurJ och AMJ proteiner inblandade i peptidoglykan-biosyntesen, WzxE och besläktade proteiner inblandade i krypterings O-antigen prekursorer MprF protein som behövs för att translokerar aminoacyleras fosfatidylglycerol över bakteriella cytoplasmiska membranet, och Xkr8 familjemedlemmar som har föreslagits att exponera PS på ytan av apoptotiska celler – återstår att testas biokemiskt. Detta understryker vikten av en robust analys för att identifiera och karakterisera scramblase aktivitet.

Här beskriver vi den rekonstitution av renat opsin, apoproteinet av fotoreceptorn rhodopsin, in stora unilamellära vesiklar (LUV: er), och efterföljande analys av scramblase aktiviteten i de resulterande proteoliposomer med användning av en fluorescensbaserad analys. Det finns flera väl beskrivna protokoll som finns i litteraturen för heterolog expression och rening av opsin, därför kommer vi intebeskriva det i detta protokoll; vi använder protokollen i et al. Goren ³ vilket ger FLAG-märkt, termostabilt opsin vid ca 100 ng / | il i 0,1% (vikt / volym) dodekylmaltosid (DDM).

Rekonstituering uppnås genom att behandla LUV med tillräcklig tvättmedel så att de sväller men inte upplösas. Under dessa betingelser, ett membranprotein – tillförs i form av protein-detergent-miceller – kommer att integrera in i liposomerna och bli rekonstitueras in i liposommembranet vid avlägsnande detergent, vilket resulterar i proteoliposomer. Att rekonstituera opsin (erhållen såsom ett renat protein i 0,1% (vikt / volym) DDM), är LUV: er framställs från en blandning av POPC (1-palmitoyl-2-oleoyl- sn-glycero-3-fosfokolin) och POPG (1- palmitoyl-2-oleoyl–sn-glycero-3- [fosfo-rac- (1-glycerol)]) och mättades med DDM innan du lägger opsin och NBF-PC. Detergenten avlägsnas därefter genom behandling av provet med polystyrenpärlor.

<p c lass = "jove_content"> Principen för fluorescensbaserad analys visas i figur 1B. LUV är symmetriskt rekonstitueras med en spårmängd av NBD-PC eller annan NBD-märkt fluorescerande fosfolipid reporter (Figur 1A). Vid tillsats av ditionit, är ett membran-impermeant dianjon, är NBD-PC-molekyler i den yttre bipacksedel av nämnda LUV gjorts icke-fluorescerande såsom nitrogrupp till NBD reduceras till en icke-fluorescerande amino-grupp. Eftersom varken NBD-PC-molekyler eller ditionit kan passera membranet på tidsskalan för försöket (<10 min), resulterar detta i 50% minskning av fluorescenssignalen. Men om liposomerna rekonstitueras med ett scramblase kan NBD-PC-molekyler i det inre bipacksedel förvränga snabbt till utsidan där de reduceras. Detta resulterar i en total förlust av fluorescens i det ideala fallet (Figur 1C).

es / ftp_upload / 54635 / 54635fig1.jpg "/>
. Figur 1: Schematisk representation av scramblase aktivitetsanalysen Analysen använder en fluorescerande NBD-märkt reporter lipid; NBF-PC visas (A). Stora unilamellära vesiklar rekonstitueras med en spårmängd av NBD-PC. Beredning producerar symmetriska blåsor, med NBD-PC fördelas jämnt i de yttre och inre broschyrer. Ditionit (S ₂ O ₄ ^2-) reducerar kemiskt nitrogrupp till NBD till en icke-fluorescerande amino-grupp. Behandling av proteinfria liposomer med ditionit (B, överst) orsakar en minskning av fluorescens 50% eftersom endast de NBD-PC-molekyler i ytterblad reduceras: ditionit är negativt laddad och kan inte korsa membranet att reagera med NBD-PC-molekyler i den inre bipacksedel. Ditionit behandling av opsin innehållande proteoliposomer (B, botten), det vill säga, scramblase aktiva proteoliposomer, resulterar i 100% förlust av fluorescence som opsin underlättar förflyttning av NBF-PC mellan den inre och den yttre bipacksedel. (C) visar idealiserade fluorescens spår som erhållits på att behandla proteinfria liposomer och opsin innehåller proteoliposomer med ditionit. Graden av fluorescensförlust är densamma i båda fallen tyder på att den kemiska reduktionen av NBF av ditionit är hastighetsbegränsande och att förvränga sker med en hastighet som är lika med eller större än hastigheten för den kemiska reaktionen. Spår som erhållits från en faktisk experiment visas i Figur 3. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

De metoder som vi beskriver kan användas för att rekonstruera och analysera andra renade proteiner, liksom blandningar av membranproteiner som erhållits, till exempel, genom att extrahera mikrosomer med rengöringsmedel ^22.

Protocol

1. Beredning av liposomer och proteoliposomer liposombildning Med användning av en glasspruta, tillsätt 1435 pl POPC (25 mg / ml, i kloroform) och 160 | j, l POPG (25 mg / ml, i kloroform) till en rundbottnad kolv för erhållande av 52,5 | j, mol lipider i ett molärt förhållande av POPC: POPG = 9: 1. Torka de lipider för 30 min med användning av en rotationsindunstare vid en rotationshastighet av 145 rpm (inget vattenbad behövs för denna volym lösningsmedel), sedan överföra kol…

Representative Results

Vi beskriver beredning av opsin i LUV att karakterisera dess scramblase aktivitet med hjälp av en fluorescensbaserad analys. Vi analyserar resultaten för att placera en undre gräns på graden av opsin-medierad fosfolipid kryptering och för att bestämma den oligomera tillstånd i vilket opsin rekonstituerar funktionellt i vesiklarna. Att identifiera optimala beredning förhållanden, är det nödvändigt att bestämma empi…

Discussion

Den scramblase aktivitetsanalysen möjligt för oss från början för att fastställa att opsin har fosfolipid scramblase aktivitet ^2. Analysen även tillät oss att karakterisera opsin s scramblase aktivitet genom att testa specificiteten (vi använde en mängd NBD-märkta reporter lipider såsom NBF-fosfatidyletanolamin, märkt med NBF på en acylkedja som visas för NBD-PC i figur 1A, eller på huvudgrupp, NBD-sfingomyelin eller NBD- fosfatidylserin ^2), effekten av blås lipid …

Materials

1-palmitoyl-2-oleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine	Avanti Polar Lipids	850457C	POPC
1-Palmitoyl-2-oleoyl-sn-glycero-3-phospho-rac-(1-glycerol) (sodium salt)	Avanti Polar Lipids	840457C	POPG
1-palmitoyl-2-{6-[7-nitro-2-1,3-benzoxadiazol-4-yl)amino]hexanoyl}-an-glycero-3-phosphocholine	Avanti Polar Lipids	810130C	NBD-PC
4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid	VWR Scientific	EM-5330	HEPES
NaCl	Sigma	S7653-1KG	NaCl
Dodecyl-β-d-maltoside	Anatrace	D310 5 GM	DDM
Fluorimeter cuvettes	sigma	C0918-100EA	cuvettes
Spectrofluorometer	Photon Technology International, Inc.		fluorimeter
Sodium hydrosulfite technical grade, 85%	Sigma	157953-5G	dithionite
GraphPad Prism 5 software			Prism
Tris Base	VWR	JTX171-3	Tris
LIPEX 10 mL extruder	Northern Lipids, Inc.		Extruder
Whatman, Drain disc, PE, 25 mm	Sigma	28156-243	Disc support
Whatman Nuclepore Track-Etched Membranes, 0.4 µm, 25 mm diameter	Sigma	WHA110607	400 nm membrane
Whatman Nucleopore Track-Etched Membranes, 0.2 µm, 25 mm diameter	Sigma	WHA110606	200 nm membrane
sodium phosphate	Sigma	S3264-500G
VWR Culture Tubes, Disposable, Borosilicate Glass, 13×100 mm	VWR Scientific	47729-572	glass tubes
Perchloric acid	Sigma	30755-500ML
Ammonium Molybdate Tetrahydrate	Sigma	A-7302	ammonium molybdate
(+)-Sodium L-ascorbate	Sigma	A7631-25G	sodium ascorbate
Bio-Beads SM2 adsorbents	Bio Rad	1523920	polystyrene beads
2.0 mL Microtubes clear	VWR Scientific	10011-742	Reconstitution tubes
Reconstitution glass tube	VWR Scientific	53283-800	Reconstitution glass tubes
Zetasizer	Malvern		DLS