Geïnduceerde pluripotente stamcellen Generation van Blood Cells Met behulp van Sendai Virus en Centrifugeren
Summary
We propose a protocol for reprogramming peripheral blood mononuclear cells (PBMCs) into induced pluripotent stem cells (iPSCs). By plating the transduced blood cells onto matrix-coated plates with centrifugation, iPSCs are successfully induced from floating cells. This technique suggests a simple and effective reprogramming protocol for cells such as PBMCs and CBMCs.
Abstract
De recente ontwikkeling van de mens geïnduceerde pluripotente stamcellen (hiPSCs) bewees dat volwassen lichaamscellen kan terugkeren naar een ongedifferentieerde, pluripotente toestand. Nu is herprogrammering uitgevoerd met diverse typen volwassen somatische cellen: keratinocyten, urine cellen, fibroblasten, enz Vroege experimenten meestal door dermale fibroblasten. Maar dit vereist een invasieve chirurgische procedure om fibroblasten van patiënten te verkrijgen. Daarom suspensie cellen, zoals bloed en urine cellen werden beschouwd als ideaal voor herprogrammering vanwege het gemak van het verkrijgen van de primaire cellen. Hier melden wij een efficiënt protocol voor iPSC generatie uit perifeer bloed mononucleaire cellen (PBMC). Door uitplating de getransduceerde PBMC serieel een nieuwe matrix gecoate platen middels centrifugatie, kan deze eenvoudig protocol bieden iPSC kolonies. Deze methode is ook toepasbaar op navelstrengbloed mononucleaire cellen (CBMCs). Deze studie geeft een eenvoudige en efficiënte protocol voor de herprogrammering van PBMCs en CBMCs.
Introduction
Stamcellen zijn een van de meest aantrekkelijke materialen klinische therapie voor de laatste decennia 1 geweest. De aantrekkelijke eigenschappen van stamcellen pluripotentie en de mogelijkheid om te hernieuwen. In 1981, werden de eerste embryonale stamcellen (SER) geïsoleerd uit de muizenembryo 2. Wanneer echter de techniek werd toegepast op menselijke embryo, het keek aantal ethische vragen.
In 2006, toen Dr. Yamanaka en zijn team geherprogrammeerd de eerste pluripotente cellen uit muizen somatische cellen, het gebied stamcel weer zijn mogelijkheid en interesse werd aangewakkerd 3. Door het leveren van een aantal factoren bepaald, pluripotente stamcellen waren succesvol "opgewekt" uit volwassen lichaamscellen, en werden dus de naam "geïnduceerde pluripotente stamcellen (iPSCs)." In 2007 werd deze techniek toegepast op menselijke cellen 4, waardoor de cellen met de exacte kenmerken van de SER, maar geen van de ethische discussie. Theoretisch iPSCs kunnen uit elke celsoort die bij een individu of patiënt. Patiëntspecifieke iPSCs stijgen als een potentieel middel dat de ziekte fenotypes en epigenetische omstandigheden van elke individuele patiënt kan simuleren. Middels gen bewerken of andere methoden die de pathogene conditie kan omkeren, kan patiëntspecifieke iPSC worden gebruikt in gepersonaliseerde geneeskunde 5. Bovendien worden iPSCs minder geassocieerd met afstoting, omdat ze dezelfde immunologische identiteit als donor, waardoor auto-transplantatie haalbaarder 6. Daarom hebben iPSCs de meest veelbelovende platform bij de ziekte modelleren, drug discovery, en regeneratieve therapieën. Gezien deze voordelen, verbeterde protocollen die zuiverder en hogere opbrengsten kan geven in de minste hoeveelheid tijd van de kleinste cel bron zijn voortdurend in ontwikkeling. Een belangrijke overweging van het vinden van de meest efficiënte protocol voor toekomstige toepassing is het primaire celtype. De meeste vroege iPSC generatie protocols zijn geoptimaliseerd voor hechtende cellen sinds de oorspronkelijke iPSC lijnen geïnduceerd door huidfibroblasten 4. De isolatie en bereiding van deze cellen zijn arbeidsintensief. Ook de isolatie van huidfibroblasten omvat invasieve chirurgische procedures die een belangrijke tekortkoming bredere toepassing kan worden.
Daarom is voor het verdere gebruik van iPSCs, een cel bron met handige overname is vereist. Bloed wordt beschouwd als een ideale bron van cellen omdat het wordt verkregen door een nogal minimaal invasieve procedure 7-9. In deze studie hebben we een eenvoudige wijziging van het protocol genereren hiPSCs uit perifeer bloed mononucleaire cellen (PBMC). Zonder de moeilijke expansieproces van een specifiek celtype, zoals CD34 + cellen werden volledig bloed cellen of PBMC's uitgeplaat op serieel-matrix gecoate platen door centrifugeren na transductie met Sendaivirus met Yamanaka factoren. Deze werkwijze verminderde de tijd die dehechting van zwevende getransduceerde cellen en verminderde het verlies van geherprogrammeerd cellen die niet kunnen hechten op eigen kracht.
Protocol
Representative Results
Discussion
Omdat embryonale stamcellen (SER) toonde diverse tekortkomingen, werd de behoefte aan een alternatief gereedschap nodig. Daarom is de ontwikkeling van geïnduceerde pluripotente stamcellen (iPSCs) door Yamanaka kwam onder de internationale schijnwerpers. Het is bijna tien jaar geleden Yamanaka ontdekt dat pluripotentie kan worden geïnduceerd door toevoeging van slechts vier genen in volwassen somatische cellen. Sinds iPSCs worden "opgewekt" van volwassen lichaamscellen, kunnen zij ethische kwesties die ooit d…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work was supported by a grant from the Basic Science Research Program through the National Research Foundation of Korea (NRF), funded by the Ministry of Science, ICT, and Future Planning (2013R1A1A1076125).
Materials
| Plasticware | |||
| 100mm Dish | TPP | 93100 | |
| 6-well Plate | TPP | 92006 | |
| 50 mL Cornical Tube | SPL | 50050 | |
| 15 mL Cornical Tube | SPL | 50015 | |
| 10 mL Disposable Pipette | Falcon | 7551 | |
| 5 mL Disposable Pipette | Falcon | 7543 | |
| 12-well Plate | TPP | 92012 | |
| 24-well Plate | TPP | 92024 | |
| PBMC Isolation Materials | |||
| DPBS | Life Technologies | 14190-144 | |
| Ficoll | GE Healthcare | 17-1440-03 | |
| StemSpan | STEMCELL Technologies | 9805 | Blood cell media |
| CC110 | STEMCELL Technologies | 8697 | Blood cell media supplement (100x) |
| iPSC Generation and Culture Materials | |||
| CytoTune-iPSC Sendai Reprogramming Kit | Life Technologies | A16518 | |
| TeSR-E8 Media | STEMCELL Technologies | 5940 | iPSC media |
| Vitronectin | Life Technologies | A14700 | |
| ROCK Inhibitor | Sigma Aldrich | Y0503 | |
| TrypLE express (TrypLE) | Life Technologies | 12604-039 | |
| ReleSR | STEMCELL Technologies | 12604-039 | Colony detaching solution |
| Quality Control Materials | |||
| 18 mm Cover Glass | Superior | HSU-0111580 | |
| 4% Paraformaldyhyde | Tech & Innovation | BPP-9004 | |
| Triton X-100 | BIOSESANG | 9002-93-1 | |
| Bovine Serum Albumin | Vector Lab | SP-5050 | |
| Anti-SSEA4 Antibody | Millipore | MAB4304 | |
| Anti-Oct4 Antibody | Santa Cruz | SC9081 | |
| Anti-TRA-1-60 Antibody | Millipore | MAB4360 | |
| Anti-Sox2 Antibody | Biolegend | 630801 | |
| Anti-TRA-1-81 Antibody | Millipore | MAB4381 | |
| Anti-Klf4 Antibody | Abcam | ab151733 | |
| Alexa Fluor 488 goat anti-mouse IgG (H+L) antibody | Molecular Probe | A11029 | |
| Alexa Fluor 594 goat anti-rabbit IgG (H+L) antibody | Molecular Probe | A11037 | |
| DAPI | Molecular Probe | D1306 | |
| Prolong gold antifade reagent | Invitrogen | P36934 | |
| Slide Glass, Coated | Hyun Il Lab-Mate | HMA-S9914 | |
| Trizol | Invitrogen | 15596-018 | |
| Chloroform | Sigma Aldrich | 366919 | |
| Isoprypylalcohol | Millipore | 109634 | |
| Ethanol | Duksan | 64-17-5 | |
| RevertAid First Strand cDNA Synthesis kit | Thermo Scientfic | K1622 | |
| i-Taq DNA Polymerase | iNtRON BIOTECH | 25021 | |
| UltraPure 10X TBE Buffer | Life Technologies | 15581-044 | |
| loading star | Dyne Bio | A750 | |
| Agarose | Sigma-Aldrich | 9012-36-6 | |
| 1kb (+) DNA ladder marker | Enzynomics | DM003 | |
| Alkaline Phosphatase | Millipore | SCR004 | |
| Tris base | Fisher Scientific | BP152-1 | Rinse Buffer |
| Sodium Chloride | Duchefa Biochemie | S0520.1000 | Rinse Buffer |
| Tween-20 | BIOSESANG | T1027 | Rinse Buffer |
| Hydrochloric Acid | Duksan | 1129 | Rinse Buffer |
Referências
- Serra, M., Brito, C., Correia, C., Alves, P. M. Process engineering of human pluripotent stem cells for clinical application. Trends Biotechnol. 30 (6), 350-359 (2012).
- Martin, G. R. Isolation of a pluripotent cell line from early mouse embryos cultured in medium conditioned by teratocarcinoma stem cells. Proc Natl Acad Sci U S A. 78 (12), 7634-7638 (1981).
- Takahashi, K., Yamanaka, S. Induction of pluripotent stem cells from mouse embryonic and adult fibroblast cultures by defined factors. Cell. 126 (4), 663-676 (2006).
- Takahashi, K., et al. Induction of pluripotent stem cells from adult human fibroblasts by defined factors. Cell. 131 (5), 861-872 (2007).
- Chun, Y. S., Byun, K., Lee, B. Induced pluripotent stem cells and personalized medicine: current progress and future perspectives. Anat Cell Biol. 44 (4), 245-255 (2011).
- Seki, T., Fukuda, K. Methods of induced pluripotent stem cells for clinical application. World J Stem Cells. 7 (1), 116-125 (2015).
- Churko, J. M., Burridge, P. W., Wu, J. C. Generation of human iPSCs from human peripheral blood mononuclear cells using non-integrative Sendai virus in chemically defined conditions. Methods Mol Biol. 1036, 81-88 (2013).
- Loh, Y. H., et al. Reprogramming of T cells from human peripheral blood. Cell Stem Cell. 7 (1), 15-19 (2010).
- Ohmine, S., et al. Induced pluripotent stem cells from GMP-grade hematopoietic progenitor cells and mononuclear myeloid cells. Stem Cell Res Ther. 2 (6), (2011).
- Mae, S., et al. Monitoring and robust induction of nephrogenic intermediate mesoderm from human pluripotent stem cells. Nat Commun. 4, 1367 (2013).
