Induite cellules souches pluripotentes génération de cellules sanguines utilisant Sendai Virus et Centrifugation

Summary

We propose a protocol for reprogramming peripheral blood mononuclear cells (PBMCs) into induced pluripotent stem cells (iPSCs). By plating the transduced blood cells onto matrix-coated plates with centrifugation, iPSCs are successfully induced from floating cells. This technique suggests a simple and effective reprogramming protocol for cells such as PBMCs and CBMCs.

Abstract

Le développement récent de cellules souches pluripotentes humaines induites (les hiPSCs) a prouvé que les cellules somatiques matures peuvent revenir à un état pluripotent indifférenciée. Maintenant, la reprogrammation est effectuée avec divers types de cellules somatiques adultes: kératinocytes, cellules de l' urine, des fibroblastes, etc. Les premières expériences ont été généralement fait avec des fibroblastes dermiques. Cependant, cela nécessitait une intervention chirurgicale invasive pour obtenir les fibroblastes des patients. Par conséquent, les cellules de la suspension, telles que des cellules de sang et d'urine ont été considérées comme idéales pour la reprogrammation en raison de la facilité d'obtention des cellules primaires. Ici, nous rapportons un protocole efficace pour la génération COPSi à partir de cellules mononucléaires du sang périphérique (CMSP). En étalant les CMSP transduites en série à une nouvelle plaque à l'aide de la matrice centrifugation revêtu, ce protocole peut facilement fournir des colonies iPSC. Cette méthode est également applicable à des cellules mononucléées du sang du cordon ombilical (CBMCs). Cette étude présente une prot simple et efficaceocol pour la reprogrammation de CMSP et CBMCs.

Introduction

Les cellules souches ont été l' un des matériaux les plus attrayants de la thérapie clinique depuis plusieurs décennies ^1. Les propriétés intéressantes de cellules souches sont pluripotence et la capacité d'auto-renouvellement. En 1981, les premières cellules souches embryonnaires (CSE) ont été isolées à partir de l'embryon de souris ^2. Cependant, quand la technique a été appliquée à des embryons humains, il fait face à plusieurs questions éthiques.

En 2006, lorsque le Dr Yamanaka et son équipe reprogrammées la première cellule pluripotente à partir de cellules somatiques de souris, le champ de cellules souches a retrouvé sa possibilité et l' intérêt a été ravivé ^3. En fournissant plusieurs facteurs définis, les cellules souches pluripotentes ont été avec succès "induits" à partir de cellules somatiques adultes, et ont donc été nommés «cellules souches pluripotentes induites (CSPi)." En 2007, cette technique a été appliquée à des cellules humaines ^4, ce qui donne des cellules avec les caractéristiques exactes des CES , mais aucun du débat éthique. Théoriquement, iPSCs peut être générée à partir de tout type de cellule obtenue à partir de tout individu ou patient. CSPi spécifiques des patients sont en hausse comme un outil potentiel qui peut simuler les phénotypes de la maladie et les conditions épigénétiques de chaque patient. En utilisant la modification génétique ou d' autres procédés qui peuvent inverser l'état pathogène, iPSCs spécifiques à un patient peuvent également être utilisés en médecine personnalisée ^5. En outre, iPSCs sont moins associée à un rejet immunitaire parce qu'ils ont la même identité immunitaire du donneur, ce qui rend l' auto-transplantation plus réalisable ^6. Par conséquent, CSPi sont devenus la plate-forme la plus prometteuse dans la modélisation de la maladie, le dépistage des drogues et des thérapies régénératrices. Compte tenu de ces avantages, les protocoles améliorés qui peuvent donner plus purs et des rendements plus élevés dans le moins de temps à partir de la source de cellules plus petites sont constamment en cours de développement. Une considération majeure de trouver le protocole le plus efficace pour l'application future est le type de cellules primaires. La plupart des premières générations proto iPSCcols sont optimisés pour les cellules adhérentes puisque les lignes iPSC originales ont été induites à partir de fibroblastes de la peau ^4. Cependant, l'isolement et la préparation de ces cellules sont main-d'œuvre. En outre, l'isolement des fibroblastes de peau comprend des interventions chirurgicales invasives qui peuvent devenir un défaut majeur pour une application plus large.

Par conséquent, pour l'utilisation ultérieure de iPSCs, une source de cellules à l'acquisition pratique est nécessaire. Le sang est considéré comme une source de cellules idéale car elle est obtenue par le biais d' une procédure minimalement invasive et non ^09/07. Dans cette étude, nous avons développé une simple modification au protocole générant hiPSCs à partir de cellules mononucléaires du sang périphérique (CMSP). Sans que le processus d'expansion difficile d'un type cellulaire spécifique, telles que les cellules CD34 +, les cellules du sang entier ou en série PBMC ont été étalées sur des plaques de matrice revêtu par centrifugation après transduction avec le virus Sendai contenant des facteurs Yamanaka. Cette méthode réduit le temps nécessaire à lafixation des cellules flottantes transduites et une diminution de la perte de cellules reprogrammées qui ne sont pas en mesure de joindre leur propre chef.

Protocol

Déclaration éthique: Ce protocole d'étude a été approuvé par le comité d'examen institutionnel de l'Université catholique de Corée (KC12TISI0861). 1. Isolement des cellules monocytaires du sang Isolement des cellules monocytaires (Jour -5) Obtenir au moins 10 ml de sang frais à partir d'un prélèvement de sang dans un tube de préparation de cellules (CPT). Transférer le sang dans un nouveau tube conique de 50 ml et dilué avec une solution saline stéril…

Representative Results

Ce protocole présente une méthode simple pour reprogrammer CMSP isolées à partir du sang. En utilisant la combinaison de placage série et la centrifugation, iPSCs ont été produites avec succès. Avec cette méthode, iPSCs pourraient être générés avec une petite quantité de cellules du sang total sans isoler ou de développer un type de cellule spécifique. Nous avons généré avec succès à partir iPSCs seulement 1×10 4 cellules dans une petite plaque de culture …

Discussion

Puisque les cellules souches embryonnaires (CSE) ont montré plusieurs lacunes, la nécessité d'un outil de remplacement était nécessaire. Par conséquent, le développement des cellules souches pluripotentes induites (CSPi) par Yamanaka est venu sous les projecteurs internationaux. Il a été depuis près de dix ans Yamanaka a découvert que la pluripotence peut être induite en ajoutant seulement quatre gènes dans des cellules somatiques adultes. Depuis CSPi sont "induites" à partir de cellules soma…

Materials

Plasticware
100mm Dish	TPP	93100
6-well Plate	TPP	92006
50 mL Cornical Tube	SPL	50050
15 mL Cornical Tube	SPL	50015
10 mL Disposable Pipette	Falcon	7551
5 mL Disposable Pipette	Falcon	7543
12-well Plate	TPP	92012
24-well Plate	TPP	92024
PBMC Isolation Materials
DPBS	Life Technologies	14190-144
Ficoll	GE Healthcare	17-1440-03
StemSpan	STEMCELL Technologies	9805	Blood cell media
CC110	STEMCELL Technologies	8697	Blood cell media supplement (100x)
iPSC Generation and Culture Materials
CytoTune-iPSC Sendai Reprogramming Kit	Life Technologies	A16518
TeSR-E8 Media	STEMCELL Technologies	5940	iPSC media
Vitronectin	Life Technologies	A14700
ROCK Inhibitor	Sigma Aldrich	Y0503
TrypLE express (TrypLE)	Life Technologies	12604-039
ReleSR	STEMCELL Technologies	12604-039	Colony detaching solution
Quality Control Materials
18 mm Cover Glass	Superior	HSU-0111580
4% Paraformaldyhyde	Tech & Innovation	BPP-9004
Triton X-100	BIOSESANG	9002-93-1
Bovine Serum Albumin	Vector Lab	SP-5050
Anti-SSEA4 Antibody	Millipore	MAB4304
Anti-Oct4 Antibody	Santa Cruz	SC9081
Anti-TRA-1-60 Antibody	Millipore	MAB4360
Anti-Sox2 Antibody	Biolegend	630801
Anti-TRA-1-81 Antibody	Millipore	MAB4381
Anti-Klf4 Antibody	Abcam	ab151733
Alexa Fluor 488 goat anti-mouse IgG (H+L) antibody	Molecular Probe	A11029
Alexa Fluor 594 goat anti-rabbit IgG (H+L) antibody	Molecular Probe	A11037
DAPI	Molecular Probe	D1306
Prolong gold antifade reagent	Invitrogen	P36934
Slide Glass, Coated	Hyun Il Lab-Mate	HMA-S9914
Trizol	Invitrogen	15596-018
Chloroform	Sigma Aldrich	366919
Isoprypylalcohol	Millipore	109634
Ethanol	Duksan	64-17-5
RevertAid First Strand cDNA Synthesis kit	Thermo Scientfic	K1622
i-Taq DNA Polymerase	iNtRON BIOTECH	25021
UltraPure 10X TBE Buffer	Life Technologies	15581-044
loading star	Dyne Bio	A750
Agarose	Sigma-Aldrich	9012-36-6
1kb (+) DNA ladder marker	Enzynomics	DM003
Alkaline Phosphatase	Millipore	SCR004
Tris base	Fisher Scientific	BP152-1	Rinse Buffer
Sodium Chloride	Duchefa Biochemie	S0520.1000	Rinse Buffer
Tween-20	BIOSESANG	T1027	Rinse Buffer
Hydrochloric Acid	Duksan	1129	Rinse Buffer