रक्त कोशिकाओं से प्रेरित pluripotent स्टेम सेल पीढ़ी सेंडाइ वायरस और centrifugation का उपयोग
Summary
We propose a protocol for reprogramming peripheral blood mononuclear cells (PBMCs) into induced pluripotent stem cells (iPSCs). By plating the transduced blood cells onto matrix-coated plates with centrifugation, iPSCs are successfully induced from floating cells. This technique suggests a simple and effective reprogramming protocol for cells such as PBMCs and CBMCs.
Abstract
मानव प्रेरित pluripotent स्टेम सेल (hiPSCs) की हाल ही में विकास ने साबित कर दिया है कि परिपक्व कोशिकाओं दैहिक एक undifferentiated, pluripotent राज्य के लिए लौट सकते हैं। आदि केरेटिनकोशिकाओं, मूत्र कोशिकाओं, fibroblasts, प्रारंभिक प्रयोगों आमतौर पर त्वचीय fibroblasts के साथ किया गया: अब, reprogramming वयस्क दैहिक कोशिकाओं के विभिन्न प्रकार के साथ किया जाता है। हालांकि, इस रोगियों से fibroblasts प्राप्त करने के लिए एक आक्रामक शल्य चिकित्सा की प्रक्रिया की आवश्यकता है। इसलिए, इस तरह के रक्त और मूत्र कोशिकाओं के रूप में निलंबन कोशिकाओं, प्राथमिक कोशिकाओं को प्राप्त करने की सुविधा की वजह से reprogramming के लिए आदर्श माना जाता था। यहाँ, हम परिधीय रक्त कोशिकाओं mononuclear (PBMCs) से IPSC पीढ़ी के लिए एक कुशल प्रोटोकॉल की रिपोर्ट। एक नया, मैट्रिक्स लेपित प्लेट का उपयोग करने के लिए centrifugation क्रमानुसार transduced PBMCs चढ़ाना द्वारा, इस प्रोटोकॉल आसानी से IPSC कालोनियों प्रदान कर सकते हैं। इस विधि को भी गर्भनाल रक्त कोशिकाओं mononuclear (CBMCs) के लिए लागू है। इस अध्ययन में यह एक सरल और कुशल prot प्रस्तुतPBMCs और CBMCs के reprogramming के लिए ocol।
Introduction
स्टेम कोशिकाओं को पिछले कई दशकों से 1 के लिए नैदानिक चिकित्सा में सबसे आकर्षक सामग्री में से एक रहे हैं। स्टेम कोशिकाओं की आकर्षक गुण pluripotency और आत्म को नवीनीकृत करने की क्षमता है। 1981 में, पहले भ्रूण स्टेम कोशिकाओं (ESCs) माउस भ्रूण 2 से अलग थे। हालांकि, जब तकनीक मानव भ्रूण के लिए लागू किया गया था, यह कई नैतिक मुद्दों का सामना करना पड़ा।
2006 में, जब डॉ यामानाका और उनकी टीम माउस दैहिक कोशिकाओं से पहले pluripotent सेल reprogrammed, स्टेम सेल के क्षेत्र में अपनी संभावना आ गया और ब्याज 3 फिर से उभार दिया गया था। कई कारकों परिभाषित पहुंचाने रखकर स्टेम कोशिकाओं को सफलतापूर्वक वयस्क दैहिक कोशिकाओं से "प्रेरित" थे, और इस तरह का नाम दिया गया "प्रेरित pluripotent स्टेम सेल (IPSCs)।" 2007 में, इस तकनीक मानव कोशिकाओं 4 के लिए लागू किया गया था, ESCs की सटीक विशेषताओं के साथ कोशिकाओं को बेदखल लेकिन नैतिक बहस से कोई नहीं। सैद्धांतिक रूप से, आईपीएससीएस किसी भी व्यक्ति या रोगी से प्राप्त किसी भी प्रकार की कोशिका से उत्पन्न हो सकता है। रोगी विशेष IPSCs एक संभावित उपकरण है कि रोग phenotypes और प्रत्येक व्यक्ति के मरीज की epigenetic की स्थिति अनुकरण कर सकते हैं के रूप में बढ़ रहे हैं। जीन संपादन या अन्य तरीकों कि रोगजनक हालत रिवर्स कर सकते हैं का उपयोग करना, रोगी विशेष IPSCs भी व्यक्तिगत दवा 5 में इस्तेमाल किया जा सकता है। इसके अलावा, IPSCs कम प्रतिरक्षा अस्वीकृति के साथ जुड़े रहे हैं क्योंकि वे दाता के रूप में ही प्रतिरक्षा पहचान है, ऑटो प्रत्यारोपण और अधिक व्यावहारिक 6 बना रही है। इसलिए, IPSCs रोग मॉडलिंग, दवा स्क्रीनिंग, और पुनर्योजी चिकित्सा में सबसे होनहार मंच बन गए हैं। इन लाभों, सुधार प्रोटोकॉल है कि छोटी से छोटी सेल स्रोत से समय कम से कम राशि में शुद्ध और अधिक पैदावार दे सकते लगातार विकास के तहत कर रहे हैं दी। भविष्य के आवेदन के लिए सबसे कुशल प्रोटोकॉल को खोजने का एक प्रमुख विचार प्राथमिक सेल प्रकार है। जल्दी IPSC पीढ़ी के अधिकांश आद्यकर्नल पक्षपाती कोशिकाओं के बाद से मूल IPSC लाइनों त्वचा fibroblasts 4 से प्रेरित थे के लिए अनुकूलित कर रहे हैं। हालांकि, अलगाव और इन कोशिकाओं की तैयारी श्रम गहन हैं। इसके अलावा, त्वचा fibroblasts के अलगाव इनवेसिव शल्य चिकित्सा प्रक्रियाओं है कि व्यापक आवेदन के लिए एक बड़ी कमी बन सकता है शामिल है।
इसलिए, IPSCs के आगे उपयोग के लिए सुविधाजनक अधिग्रहण के साथ एक सेल स्रोत की आवश्यकता है। क्योंकि यह एक नहीं बल्कि न्यूनतम इनवेसिव प्रक्रिया 7-9 के माध्यम से प्राप्त किया जाता है खून एक आदर्श सेल स्रोत के रूप में माना जाता है। इस अध्ययन में, हम प्रोटोकॉल परिधीय रक्त कोशिकाओं mononuclear (PBMCs) से hiPSCs पैदा करने के लिए एक सरल संशोधन विकसित की है। ऐसे CD34 + कोशिकाओं के रूप में एक विशेष सेल प्रकार की मुश्किल विस्तार की प्रक्रिया के बिना, पूरे रक्त कोशिकाओं या PBMCs क्रमानुसार मैट्रिक्स लेपित प्लेटों पर centrifugation द्वारा यामानाका कारकों युक्त सेंडाइ वायरस से पारगमन के बाद चढ़ाया गया। इस विधि समय के लिए आवश्यक समय को कमट्रांसड्यूस अस्थायी कोशिकाओं की कुर्की और reprogrammed कोशिकाओं है कि अपने दम पर संलग्न करने के लिए सक्षम नहीं थे के नुकसान में कमी आई है।
Protocol
Representative Results
Discussion
चूंकि भ्रूण स्टेम कोशिकाओं (ESCs) कई कमियों से पता चला है, एक वैकल्पिक उपकरण की जरूरत के लिए आवश्यक था। इसलिए, (IPSCs) प्रेरित pluripotent स्टेम कोशिकाओं के विकास यामानाका द्वारा अंतरराष्ट्रीय सुर्खियों में आया था। ?…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work was supported by a grant from the Basic Science Research Program through the National Research Foundation of Korea (NRF), funded by the Ministry of Science, ICT, and Future Planning (2013R1A1A1076125).
Materials
| Plasticware | |||
| 100mm Dish | TPP | 93100 | |
| 6-well Plate | TPP | 92006 | |
| 50 mL Cornical Tube | SPL | 50050 | |
| 15 mL Cornical Tube | SPL | 50015 | |
| 10 mL Disposable Pipette | Falcon | 7551 | |
| 5 mL Disposable Pipette | Falcon | 7543 | |
| 12-well Plate | TPP | 92012 | |
| 24-well Plate | TPP | 92024 | |
| PBMC Isolation Materials | |||
| DPBS | Life Technologies | 14190-144 | |
| Ficoll | GE Healthcare | 17-1440-03 | |
| StemSpan | STEMCELL Technologies | 9805 | Blood cell media |
| CC110 | STEMCELL Technologies | 8697 | Blood cell media supplement (100x) |
| iPSC Generation and Culture Materials | |||
| CytoTune-iPSC Sendai Reprogramming Kit | Life Technologies | A16518 | |
| TeSR-E8 Media | STEMCELL Technologies | 5940 | iPSC media |
| Vitronectin | Life Technologies | A14700 | |
| ROCK Inhibitor | Sigma Aldrich | Y0503 | |
| TrypLE express (TrypLE) | Life Technologies | 12604-039 | |
| ReleSR | STEMCELL Technologies | 12604-039 | Colony detaching solution |
| Quality Control Materials | |||
| 18 mm Cover Glass | Superior | HSU-0111580 | |
| 4% Paraformaldyhyde | Tech & Innovation | BPP-9004 | |
| Triton X-100 | BIOSESANG | 9002-93-1 | |
| Bovine Serum Albumin | Vector Lab | SP-5050 | |
| Anti-SSEA4 Antibody | Millipore | MAB4304 | |
| Anti-Oct4 Antibody | Santa Cruz | SC9081 | |
| Anti-TRA-1-60 Antibody | Millipore | MAB4360 | |
| Anti-Sox2 Antibody | Biolegend | 630801 | |
| Anti-TRA-1-81 Antibody | Millipore | MAB4381 | |
| Anti-Klf4 Antibody | Abcam | ab151733 | |
| Alexa Fluor 488 goat anti-mouse IgG (H+L) antibody | Molecular Probe | A11029 | |
| Alexa Fluor 594 goat anti-rabbit IgG (H+L) antibody | Molecular Probe | A11037 | |
| DAPI | Molecular Probe | D1306 | |
| Prolong gold antifade reagent | Invitrogen | P36934 | |
| Slide Glass, Coated | Hyun Il Lab-Mate | HMA-S9914 | |
| Trizol | Invitrogen | 15596-018 | |
| Chloroform | Sigma Aldrich | 366919 | |
| Isoprypylalcohol | Millipore | 109634 | |
| Ethanol | Duksan | 64-17-5 | |
| RevertAid First Strand cDNA Synthesis kit | Thermo Scientfic | K1622 | |
| i-Taq DNA Polymerase | iNtRON BIOTECH | 25021 | |
| UltraPure 10X TBE Buffer | Life Technologies | 15581-044 | |
| loading star | Dyne Bio | A750 | |
| Agarose | Sigma-Aldrich | 9012-36-6 | |
| 1kb (+) DNA ladder marker | Enzynomics | DM003 | |
| Alkaline Phosphatase | Millipore | SCR004 | |
| Tris base | Fisher Scientific | BP152-1 | Rinse Buffer |
| Sodium Chloride | Duchefa Biochemie | S0520.1000 | Rinse Buffer |
| Tween-20 | BIOSESANG | T1027 | Rinse Buffer |
| Hydrochloric Acid | Duksan | 1129 | Rinse Buffer |
Referências
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