Induced pluripotent stamcelle Generation fra Blood Cells hjelp Sendai Virus og sentrifugering
Summary
We propose a protocol for reprogramming peripheral blood mononuclear cells (PBMCs) into induced pluripotent stem cells (iPSCs). By plating the transduced blood cells onto matrix-coated plates with centrifugation, iPSCs are successfully induced from floating cells. This technique suggests a simple and effective reprogramming protocol for cells such as PBMCs and CBMCs.
Abstract
Den siste utviklingen av menneskeskapte pluripotent stamceller (hiPSCs) viste at modne somatiske celler kan gå tilbake til en udifferensiert, pluripotent tilstand. Nå er omprogrammering utført med forskjellige typer av voksen somatiske celler: keratinocytter, urin celler, fibroblaster, etc. Tidlige forsøk ble vanligvis utført med dermale fibroblaster. Men dette krevde en invasiv kirurgisk prosedyre for å oppnå fibroblaster fra pasientene. Derfor suspensjonsceller, for eksempel blod og urin celler, ble ansett som ideell for omprogrammering på grunn av fordelene med å skaffe de primære celler. Her rapporterer vi en effektiv protokoll for IPSC generasjon fra perifere mononukleære blodceller (PBMC). Ved plating de omsatte PBMC serielt til en ny, matrise-belagt plate ved hjelp av sentrifugering, kan denne protokollen lett gi IPSC kolonier. Denne fremgangsmåte er også anvendelig for å navlestreng blod mononukleære celler (CBMCs). Denne studien viser en enkel og effektiv protocol for omprogrammering av PBMC og CBMCs.
Introduction
Stamceller har vært en av de mest attraktive materialer i klinisk terapi for de siste flere tiår 1. De attraktive egenskapene til stamceller er pluripotency og evnen til å fornye seg selv. I 1981 ble den første embryonale stamceller (ESCS) isolert fra mus embryo 2. Men når teknikken ble brukt til menneskelige embryo, det sto overfor flere etiske problemstillinger.
I 2006, da Dr. Yamanaka og hans team omprogrammert den første pluripotent celle fra musesomatiske celler, gjenvant stamcellefeltet sin mulighet og interesse ble taktene tre. Ved å levere flere definerte faktorer, pluripotente stamceller var vellykket "indusert" fra voksne somatiske celler, og ble dermed kåret til "indusert pluripotent stamceller (iPSCs)." I 2007 ble denne teknikken brukt til menneskeceller 4, som gir cellene med de eksakte egenskapene til ESCs men ingen av den etiske debatten. Teoretisk iPSCs kan genereres fra en hvilken som helst celletype hentet fra en hvilken som helst person eller pasient. Pasient-spesifikke iPSCs stiger som en potensiell verktøy som kan simulere sykdommen fenotyper og epigenetiske forhold til hver enkelt pasient. Ved hjelp av genet redigering eller andre metoder som kan reversere den patogene tilstand, kan pasientspesifikke iPSCs også brukes i personlig medisin 5. Videre er iPSCs mindre forbundet med immunavstøtning fordi de har den samme identitet som immun donor, slik at auto-transplantasjon mer gjennomfør 6. Derfor har iPSCs blitt den mest lovende plattformen i sykdom modellering, legemiddelscreening, og regenererende behandling. Gitt disse fordelene, forbedret protokoller som kan gi renere og høyere avkastning på minst mulig tid fra den minste celle kilden er stadig under utvikling. En viktig faktor for å finne den mest effektive protokollen for fremtidig anvendelse er den primære celletype. De fleste av de tidlige IPSC generasjon protokolonner er optimalisert for heft celler siden den originale IPSC linjer ble indusert av hud fibroblaster 4. Imidlertid isolering og fremstilling av disse cellene er arbeidskrevende. Dessuten er isolering av hudfibroblaster omfatter invasive kirurgiske inngrep som kan bli en stor brist for bredere anvendelse.
Derfor, for den videre anvendelse av iPSCs, er en celle kilde med praktisk anskaffelse nødvendig. Blod er å anse som en ideell celle kilde siden det er innhentet gjennom en ganske minimal invasiv prosedyre 7-9. I denne studien, har vi utviklet en enkel modifikasjon av protokollen generere hiPSCs fra perifere mononukleære blodceller (PBMC). Uten den vanskelige prosessen med utvidelse av en spesifikk celletype, for eksempel CD34 + celler, ble hele blodceller eller PBMC serielt sådd ut på matrix-belagte plater ved sentrifugering etter transduksjon med Sendai-virus inneholdende Yamanaka faktorer. Denne fremgangsmåten reduserer tiden som kreves forfesting av transduserte celler flytende og redusert tap av omprogrammeres celler som ikke var i stand til å feste på egenhånd.
Protocol
Representative Results
Discussion
Siden embryonale stamceller (ESCS) viste flere mangler, ble det behov for et alternativt verktøy er nødvendig. Derfor er utviklingen av induserte pluripotente stamceller (iPSCs) av Yamanaka kom under det internasjonale søkelyset. Det har vært nesten et tiår siden Yamanaka oppdaget at pluripotency kan induseres ved å legge til bare fire gener inn voksne somatiske celler. Siden iPSCs er "indusert" fra modne somatiske celler, kan de unngå etiske problemstillinger som en gang hadde vært bekymring knyttet t…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work was supported by a grant from the Basic Science Research Program through the National Research Foundation of Korea (NRF), funded by the Ministry of Science, ICT, and Future Planning (2013R1A1A1076125).
Materials
| Plasticware | |||
| 100mm Dish | TPP | 93100 | |
| 6-well Plate | TPP | 92006 | |
| 50 mL Cornical Tube | SPL | 50050 | |
| 15 mL Cornical Tube | SPL | 50015 | |
| 10 mL Disposable Pipette | Falcon | 7551 | |
| 5 mL Disposable Pipette | Falcon | 7543 | |
| 12-well Plate | TPP | 92012 | |
| 24-well Plate | TPP | 92024 | |
| PBMC Isolation Materials | |||
| DPBS | Life Technologies | 14190-144 | |
| Ficoll | GE Healthcare | 17-1440-03 | |
| StemSpan | STEMCELL Technologies | 9805 | Blood cell media |
| CC110 | STEMCELL Technologies | 8697 | Blood cell media supplement (100x) |
| iPSC Generation and Culture Materials | |||
| CytoTune-iPSC Sendai Reprogramming Kit | Life Technologies | A16518 | |
| TeSR-E8 Media | STEMCELL Technologies | 5940 | iPSC media |
| Vitronectin | Life Technologies | A14700 | |
| ROCK Inhibitor | Sigma Aldrich | Y0503 | |
| TrypLE express (TrypLE) | Life Technologies | 12604-039 | |
| ReleSR | STEMCELL Technologies | 12604-039 | Colony detaching solution |
| Quality Control Materials | |||
| 18 mm Cover Glass | Superior | HSU-0111580 | |
| 4% Paraformaldyhyde | Tech & Innovation | BPP-9004 | |
| Triton X-100 | BIOSESANG | 9002-93-1 | |
| Bovine Serum Albumin | Vector Lab | SP-5050 | |
| Anti-SSEA4 Antibody | Millipore | MAB4304 | |
| Anti-Oct4 Antibody | Santa Cruz | SC9081 | |
| Anti-TRA-1-60 Antibody | Millipore | MAB4360 | |
| Anti-Sox2 Antibody | Biolegend | 630801 | |
| Anti-TRA-1-81 Antibody | Millipore | MAB4381 | |
| Anti-Klf4 Antibody | Abcam | ab151733 | |
| Alexa Fluor 488 goat anti-mouse IgG (H+L) antibody | Molecular Probe | A11029 | |
| Alexa Fluor 594 goat anti-rabbit IgG (H+L) antibody | Molecular Probe | A11037 | |
| DAPI | Molecular Probe | D1306 | |
| Prolong gold antifade reagent | Invitrogen | P36934 | |
| Slide Glass, Coated | Hyun Il Lab-Mate | HMA-S9914 | |
| Trizol | Invitrogen | 15596-018 | |
| Chloroform | Sigma Aldrich | 366919 | |
| Isoprypylalcohol | Millipore | 109634 | |
| Ethanol | Duksan | 64-17-5 | |
| RevertAid First Strand cDNA Synthesis kit | Thermo Scientfic | K1622 | |
| i-Taq DNA Polymerase | iNtRON BIOTECH | 25021 | |
| UltraPure 10X TBE Buffer | Life Technologies | 15581-044 | |
| loading star | Dyne Bio | A750 | |
| Agarose | Sigma-Aldrich | 9012-36-6 | |
| 1kb (+) DNA ladder marker | Enzynomics | DM003 | |
| Alkaline Phosphatase | Millipore | SCR004 | |
| Tris base | Fisher Scientific | BP152-1 | Rinse Buffer |
| Sodium Chloride | Duchefa Biochemie | S0520.1000 | Rinse Buffer |
| Tween-20 | BIOSESANG | T1027 | Rinse Buffer |
| Hydrochloric Acid | Duksan | 1129 | Rinse Buffer |
Referências
- Serra, M., Brito, C., Correia, C., Alves, P. M. Process engineering of human pluripotent stem cells for clinical application. Trends Biotechnol. 30 (6), 350-359 (2012).
- Martin, G. R. Isolation of a pluripotent cell line from early mouse embryos cultured in medium conditioned by teratocarcinoma stem cells. Proc Natl Acad Sci U S A. 78 (12), 7634-7638 (1981).
- Takahashi, K., Yamanaka, S. Induction of pluripotent stem cells from mouse embryonic and adult fibroblast cultures by defined factors. Cell. 126 (4), 663-676 (2006).
- Takahashi, K., et al. Induction of pluripotent stem cells from adult human fibroblasts by defined factors. Cell. 131 (5), 861-872 (2007).
- Chun, Y. S., Byun, K., Lee, B. Induced pluripotent stem cells and personalized medicine: current progress and future perspectives. Anat Cell Biol. 44 (4), 245-255 (2011).
- Seki, T., Fukuda, K. Methods of induced pluripotent stem cells for clinical application. World J Stem Cells. 7 (1), 116-125 (2015).
- Churko, J. M., Burridge, P. W., Wu, J. C. Generation of human iPSCs from human peripheral blood mononuclear cells using non-integrative Sendai virus in chemically defined conditions. Methods Mol Biol. 1036, 81-88 (2013).
- Loh, Y. H., et al. Reprogramming of T cells from human peripheral blood. Cell Stem Cell. 7 (1), 15-19 (2010).
- Ohmine, S., et al. Induced pluripotent stem cells from GMP-grade hematopoietic progenitor cells and mononuclear myeloid cells. Stem Cell Res Ther. 2 (6), (2011).
- Mae, S., et al. Monitoring and robust induction of nephrogenic intermediate mesoderm from human pluripotent stem cells. Nat Commun. 4, 1367 (2013).
