Inducida por la generación de células madre pluripotentes a partir de células de la sangre usando el virus Sendai y centrifugación
Summary
We propose a protocol for reprogramming peripheral blood mononuclear cells (PBMCs) into induced pluripotent stem cells (iPSCs). By plating the transduced blood cells onto matrix-coated plates with centrifugation, iPSCs are successfully induced from floating cells. This technique suggests a simple and effective reprogramming protocol for cells such as PBMCs and CBMCs.
Abstract
El reciente desarrollo de las células madre pluripotentes inducidas humanas (hiPSCs) demostró que las células somáticas maduras pueden volver a un estado indiferenciado, pluripotente. Ahora, la reprogramación se lleva a cabo con varios tipos de células somáticas adultas: queratinocitos, células de orina, fibroblastos, etc. Los primeros experimentos se hace generalmente con fibroblastos dérmicos. Sin embargo, esto requiere un procedimiento quirúrgico invasivo para obtener fibroblastos de los pacientes. Por lo tanto, las células en suspensión, tales como células de sangre y orina, se considera ideal para la reprogramación debido a la comodidad de la obtención de las células primarias. Aquí, se presenta un protocolo eficiente para la generación de IPSC a partir de células mononucleares de sangre periférica (CMSP). Mediante siembra de las PBMCs transducidas en serie a una nueva placa usando centrifugación matriz recubierta, este protocolo puede proporcionar fácilmente colonias IPSC. Este método es aplicable a células mononucleares de sangre de cordón umbilical (CBMC) también. Este estudio presenta una prot simple y eficienteocol para la reprogramación de las PBMC y CBMC.
Introduction
Las células madre han sido uno de los materiales más atractivos de la terapia clínica desde hace varias décadas 1. Las propiedades atractivas de las células madre son la pluripotencia y la capacidad de auto-renovación. En 1981, se aislaron las primeras células madre embrionarias (CES) a partir del embrión de ratón 2. Sin embargo, cuando la técnica se aplicó a los embriones humanos, se enfrentó a varios problemas éticos.
En 2006, cuando el Dr. Yamanaka y su equipo reprogramar la primera célula pluripotente de las células somáticas de ratón, el campo de células madre recuperó su posibilidad y el interés se reavivó 3. Mediante la entrega de varios factores definidos, las células madre pluripotentes fueron correctamente "inducidos" a partir de células somáticas adultas, y por lo tanto se denominan "células madre pluripotentes inducidas (iPS)." En 2007, esta técnica se aplicó a las células humanas 4, las células con las características exactas de los CES rendimiento pero ninguno de debate ético. Teóricamente, las iPSCs puede generarse a partir de cualquier tipo de célula obtenido de cualquier persona o paciente. iPS específicas de pacientes se están levantando como una herramienta potencial que puede simular los fenotipos de la enfermedad y las condiciones epigenéticas de cada paciente individual. El uso de la edición de genes u otros métodos que pueden revertir la condición patógena, iPSCs específicos del paciente también pueden ser utilizados en la medicina personalizada 5. Por otra parte, iPSCs están menos asociadas con el rechazo inmunológico debido a que tienen la misma identidad inmune como donante, haciendo auto-trasplante más factible 6. Por lo tanto, iPSCs se han convertido en la plataforma más prometedora en el modelado de la enfermedad, la detección de drogas y terapias regenerativas. Teniendo en cuenta estos beneficios, la mejora de los protocolos que se dan más puro y mayores rendimientos en el menor tiempo posible de la fuente de células más pequeñas son constantemente en desarrollo. Una consideración importante de encontrar el protocolo más eficiente para la aplicación en el futuro es el principal tipo de células. La mayor parte de los primeros proto generación de IPSCcols están optimizados para las células adherentes ya que las líneas de IPSC originales fueron inducidas a partir de fibroblastos de la piel 4. Sin embargo, el aislamiento y la preparación de estas células son mano de obra intensiva. Además, el aislamiento de los fibroblastos de la piel incluye procedimientos quirúrgicos invasivos que pueden convertirse en un defecto importante para una aplicación más amplia.
Por lo tanto, para el uso adicional de iPSCs, se requiere una fuente de células con la adquisición conveniente. La sangre se considera como una fuente de células ideal, ya que se obtiene a través de un procedimiento bastante mínimamente invasiva 7-9. En este estudio, hemos desarrollado una simple modificación al protocolo de generación de hiPSCs a partir de células mononucleares de sangre periférica (PBMCs). Sin el proceso de expansión difícil de un tipo específico de célula, como las células CD34 +, las células de sangre entera o PBMCs se sembraron en serie en placas de matriz recubierto por centrifugación después de la transducción con el virus de Sendai que contiene factores de Yamanaka. Este método reduce el tiempo requerido para launión de las células transducidas flotantes y la disminución de la pérdida de células reprogramadas que no eran capaces de unirse por su cuenta.
Protocol
Representative Results
Discussion
Dado que las células madre embrionarias (CME) mostraron varias deficiencias, se requiere la necesidad de una herramienta alternativa. Por lo tanto, el desarrollo de las células madre pluripotentes inducidas (iPS) por Yamanaka fue objeto de la atención internacional. Ha sido casi una década desde Yamanaka descubrió que la pluripotencia se puede inducir mediante la adición de sólo cuatro genes en células somáticas adultas. Desde iPSCs son "inducidos" a partir de células somáticas maduras, pueden evadi…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work was supported by a grant from the Basic Science Research Program through the National Research Foundation of Korea (NRF), funded by the Ministry of Science, ICT, and Future Planning (2013R1A1A1076125).
Materials
| Plasticware | |||
| 100mm Dish | TPP | 93100 | |
| 6-well Plate | TPP | 92006 | |
| 50 mL Cornical Tube | SPL | 50050 | |
| 15 mL Cornical Tube | SPL | 50015 | |
| 10 mL Disposable Pipette | Falcon | 7551 | |
| 5 mL Disposable Pipette | Falcon | 7543 | |
| 12-well Plate | TPP | 92012 | |
| 24-well Plate | TPP | 92024 | |
| PBMC Isolation Materials | |||
| DPBS | Life Technologies | 14190-144 | |
| Ficoll | GE Healthcare | 17-1440-03 | |
| StemSpan | STEMCELL Technologies | 9805 | Blood cell media |
| CC110 | STEMCELL Technologies | 8697 | Blood cell media supplement (100x) |
| iPSC Generation and Culture Materials | |||
| CytoTune-iPSC Sendai Reprogramming Kit | Life Technologies | A16518 | |
| TeSR-E8 Media | STEMCELL Technologies | 5940 | iPSC media |
| Vitronectin | Life Technologies | A14700 | |
| ROCK Inhibitor | Sigma Aldrich | Y0503 | |
| TrypLE express (TrypLE) | Life Technologies | 12604-039 | |
| ReleSR | STEMCELL Technologies | 12604-039 | Colony detaching solution |
| Quality Control Materials | |||
| 18 mm Cover Glass | Superior | HSU-0111580 | |
| 4% Paraformaldyhyde | Tech & Innovation | BPP-9004 | |
| Triton X-100 | BIOSESANG | 9002-93-1 | |
| Bovine Serum Albumin | Vector Lab | SP-5050 | |
| Anti-SSEA4 Antibody | Millipore | MAB4304 | |
| Anti-Oct4 Antibody | Santa Cruz | SC9081 | |
| Anti-TRA-1-60 Antibody | Millipore | MAB4360 | |
| Anti-Sox2 Antibody | Biolegend | 630801 | |
| Anti-TRA-1-81 Antibody | Millipore | MAB4381 | |
| Anti-Klf4 Antibody | Abcam | ab151733 | |
| Alexa Fluor 488 goat anti-mouse IgG (H+L) antibody | Molecular Probe | A11029 | |
| Alexa Fluor 594 goat anti-rabbit IgG (H+L) antibody | Molecular Probe | A11037 | |
| DAPI | Molecular Probe | D1306 | |
| Prolong gold antifade reagent | Invitrogen | P36934 | |
| Slide Glass, Coated | Hyun Il Lab-Mate | HMA-S9914 | |
| Trizol | Invitrogen | 15596-018 | |
| Chloroform | Sigma Aldrich | 366919 | |
| Isoprypylalcohol | Millipore | 109634 | |
| Ethanol | Duksan | 64-17-5 | |
| RevertAid First Strand cDNA Synthesis kit | Thermo Scientfic | K1622 | |
| i-Taq DNA Polymerase | iNtRON BIOTECH | 25021 | |
| UltraPure 10X TBE Buffer | Life Technologies | 15581-044 | |
| loading star | Dyne Bio | A750 | |
| Agarose | Sigma-Aldrich | 9012-36-6 | |
| 1kb (+) DNA ladder marker | Enzynomics | DM003 | |
| Alkaline Phosphatase | Millipore | SCR004 | |
| Tris base | Fisher Scientific | BP152-1 | Rinse Buffer |
| Sodium Chloride | Duchefa Biochemie | S0520.1000 | Rinse Buffer |
| Tween-20 | BIOSESANG | T1027 | Rinse Buffer |
| Hydrochloric Acid | Duksan | 1129 | Rinse Buffer |
Referências
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