Inducerade pluripotenta stamceller Generation från blodkroppar med användning Sendai virus och centrifugering
Summary
We propose a protocol for reprogramming peripheral blood mononuclear cells (PBMCs) into induced pluripotent stem cells (iPSCs). By plating the transduced blood cells onto matrix-coated plates with centrifugation, iPSCs are successfully induced from floating cells. This technique suggests a simple and effective reprogramming protocol for cells such as PBMCs and CBMCs.
Abstract
Den senaste tidens utveckling av mänskliga inducerade pluripotenta stamceller (hiPSCs) visade att mogna somatiska celler kan återgå till en odifferentierad, pluripotent tillstånd. Nu är omprogrammering göras med olika typer av vuxna somatiska celler: keratinocyter, urin-celler, fibroblaster, etc. Tidiga experiment vanligen med dermala fibroblaster. Detta krävde dock ett invasivt kirurgiskt ingrepp för att erhålla fibroblaster från patienterna. Därför suspensionsceller, såsom blod-och urinceller, ansågs vara idealisk för omprogrammering på grund av bekvämlighet att erhålla de primära cellerna. Här rapporterar vi ett effektivt protokoll för iPSC generationen från perifera mononukleära blodceller (PBMC). Genom att stryka de omvandlade PBMC serie till en ny, matris-belagda plattan med hjälp av centrifugering, kan detta protokoll enkelt ge IPSC kolonier. Denna metod är också tillämplig på navelsträngsblodmononukleära celler (CBMCs). Denna studie presenterar en enkel och effektiv protocol för omprogrammering av PBMC och CBMCs.
Introduction
Stamceller har varit en av de mest attraktiva material i klinisk terapi för de senaste årtiondena 1. De attraktiva egenskaper stamceller är pluripotens och förmågan att själv förnya. 1981 var de första embryonala stamceller (ESCS) isolerad från musembryo 2. Men när tekniken tillämpas på mänskliga embryon, inför den flera etiska frågor.
År 2006, när Dr. Yamanaka och hans team omprogrammeras den första pluripotent cell från mus somatiska celler, stamcellsområdet återfått sin möjlighet och intresse återuppväcktes 3. Genom att leverera flera definierade faktorer, pluripotenta stamceller var framgångsrikt "inducerad" från vuxna somatiska celler, och har således namnet "inducerade pluripotenta stamceller (iPSCs)." År 2007 var denna teknik tillämpas på mänskliga celler 4, vilket ger celler med de exakta egenskaperna hos ESCs men ingen av etisk debatt. Teoretiskt, iPSCs kan genereras från alla celltyper som erhållits från någon individ eller patient. Patientspecifika iPSCs ökar som ett potentiellt verktyg som kan simulera fenotyper sjukdom och epigenetiska förhållandena i varje enskild patient. Med hjälp av genen redigering eller andra metoder som kan vända den patogena tillstånd, kan patientspecifika iPSCs också användas i personlig medicin fem. Dessutom är iPSCs mindre samband med avstötning eftersom de har samma immun identitet som donator, vilket gör auto-transplantation mer genomförbar 6. Därför har iPSCs blivit den mest lovande plattform i sjukdomsmodellering, drug screening, och regenerativ behandlingar. Med tanke på dessa fördelar, förbättrade protokoll som kan ge renare och högre avkastning på kortast tid från den minsta cellkällan är ständigt under utveckling. En viktig fråga att hitta den mest effektiva protokollet för framtida tillämpning är den primära celltyp. De flesta av de tidiga iPSC generationen protocols är optimerade för vidhäftande celler sedan de ursprungliga IPSC linjerna inducerades ur hudfibroblaster 4. Emellertid isolering och beredning av dessa celler är arbetskrävande. Även isolering av hudfibroblaster inkluderar kirurgiska ingrepp som kan bli en stor brist för bredare tillämpning.
Därför för vidare användning av iPSCs är en cellkälla med bekväm förvärv krävs. Blod betraktas som en ideal cellkälla eftersom den erhålls genom en ganska minimalt invasiv procedur 7-9. I denna studie har vi utvecklat en enkel modifiering av protokollet genererar hiPSCs från perifera mononukleära blodceller (PBMC). Utan den svåra expansionsprocessen av en specifik celltyp, såsom CD34 + celler, hela blodkroppar eller PBMC seriellt ströks ut på matris-belagda plattor genom centrifugering efter transduktion med Sendai-virus innehållande Yamanaka faktorer. Denna metod reduceras den tid som krävs förfastsättning av transducerade flytande celler och minskade förlusten av omprogrammerade celler som inte var i stånd att fästa på egen hand.
Protocol
Representative Results
Discussion
Eftersom embryonala stamceller (ESC) visade flera brister, var behovet av ett alternativt verktyg som behövs. Därför är utvecklingen av inducerade pluripotenta stamceller (iPSCs) av Yamanaka kom under den internationella rampljuset. Det har varit nästan ett decennium sedan Yamanaka upptäckte att pluripotens kan induceras genom att tillsätta endast fyra gener i vuxna somatiska celler. Eftersom iPSCs är "inducerad" från mogna somatiska celler, kan de kringgå etiska frågor som en gång hade varit en an…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work was supported by a grant from the Basic Science Research Program through the National Research Foundation of Korea (NRF), funded by the Ministry of Science, ICT, and Future Planning (2013R1A1A1076125).
Materials
| Plasticware | |||
| 100mm Dish | TPP | 93100 | |
| 6-well Plate | TPP | 92006 | |
| 50 mL Cornical Tube | SPL | 50050 | |
| 15 mL Cornical Tube | SPL | 50015 | |
| 10 mL Disposable Pipette | Falcon | 7551 | |
| 5 mL Disposable Pipette | Falcon | 7543 | |
| 12-well Plate | TPP | 92012 | |
| 24-well Plate | TPP | 92024 | |
| PBMC Isolation Materials | |||
| DPBS | Life Technologies | 14190-144 | |
| Ficoll | GE Healthcare | 17-1440-03 | |
| StemSpan | STEMCELL Technologies | 9805 | Blood cell media |
| CC110 | STEMCELL Technologies | 8697 | Blood cell media supplement (100x) |
| iPSC Generation and Culture Materials | |||
| CytoTune-iPSC Sendai Reprogramming Kit | Life Technologies | A16518 | |
| TeSR-E8 Media | STEMCELL Technologies | 5940 | iPSC media |
| Vitronectin | Life Technologies | A14700 | |
| ROCK Inhibitor | Sigma Aldrich | Y0503 | |
| TrypLE express (TrypLE) | Life Technologies | 12604-039 | |
| ReleSR | STEMCELL Technologies | 12604-039 | Colony detaching solution |
| Quality Control Materials | |||
| 18 mm Cover Glass | Superior | HSU-0111580 | |
| 4% Paraformaldyhyde | Tech & Innovation | BPP-9004 | |
| Triton X-100 | BIOSESANG | 9002-93-1 | |
| Bovine Serum Albumin | Vector Lab | SP-5050 | |
| Anti-SSEA4 Antibody | Millipore | MAB4304 | |
| Anti-Oct4 Antibody | Santa Cruz | SC9081 | |
| Anti-TRA-1-60 Antibody | Millipore | MAB4360 | |
| Anti-Sox2 Antibody | Biolegend | 630801 | |
| Anti-TRA-1-81 Antibody | Millipore | MAB4381 | |
| Anti-Klf4 Antibody | Abcam | ab151733 | |
| Alexa Fluor 488 goat anti-mouse IgG (H+L) antibody | Molecular Probe | A11029 | |
| Alexa Fluor 594 goat anti-rabbit IgG (H+L) antibody | Molecular Probe | A11037 | |
| DAPI | Molecular Probe | D1306 | |
| Prolong gold antifade reagent | Invitrogen | P36934 | |
| Slide Glass, Coated | Hyun Il Lab-Mate | HMA-S9914 | |
| Trizol | Invitrogen | 15596-018 | |
| Chloroform | Sigma Aldrich | 366919 | |
| Isoprypylalcohol | Millipore | 109634 | |
| Ethanol | Duksan | 64-17-5 | |
| RevertAid First Strand cDNA Synthesis kit | Thermo Scientfic | K1622 | |
| i-Taq DNA Polymerase | iNtRON BIOTECH | 25021 | |
| UltraPure 10X TBE Buffer | Life Technologies | 15581-044 | |
| loading star | Dyne Bio | A750 | |
| Agarose | Sigma-Aldrich | 9012-36-6 | |
| 1kb (+) DNA ladder marker | Enzynomics | DM003 | |
| Alkaline Phosphatase | Millipore | SCR004 | |
| Tris base | Fisher Scientific | BP152-1 | Rinse Buffer |
| Sodium Chloride | Duchefa Biochemie | S0520.1000 | Rinse Buffer |
| Tween-20 | BIOSESANG | T1027 | Rinse Buffer |
| Hydrochloric Acid | Duksan | 1129 | Rinse Buffer |
Referências
- Serra, M., Brito, C., Correia, C., Alves, P. M. Process engineering of human pluripotent stem cells for clinical application. Trends Biotechnol. 30 (6), 350-359 (2012).
- Martin, G. R. Isolation of a pluripotent cell line from early mouse embryos cultured in medium conditioned by teratocarcinoma stem cells. Proc Natl Acad Sci U S A. 78 (12), 7634-7638 (1981).
- Takahashi, K., Yamanaka, S. Induction of pluripotent stem cells from mouse embryonic and adult fibroblast cultures by defined factors. Cell. 126 (4), 663-676 (2006).
- Takahashi, K., et al. Induction of pluripotent stem cells from adult human fibroblasts by defined factors. Cell. 131 (5), 861-872 (2007).
- Chun, Y. S., Byun, K., Lee, B. Induced pluripotent stem cells and personalized medicine: current progress and future perspectives. Anat Cell Biol. 44 (4), 245-255 (2011).
- Seki, T., Fukuda, K. Methods of induced pluripotent stem cells for clinical application. World J Stem Cells. 7 (1), 116-125 (2015).
- Churko, J. M., Burridge, P. W., Wu, J. C. Generation of human iPSCs from human peripheral blood mononuclear cells using non-integrative Sendai virus in chemically defined conditions. Methods Mol Biol. 1036, 81-88 (2013).
- Loh, Y. H., et al. Reprogramming of T cells from human peripheral blood. Cell Stem Cell. 7 (1), 15-19 (2010).
- Ohmine, S., et al. Induced pluripotent stem cells from GMP-grade hematopoietic progenitor cells and mononuclear myeloid cells. Stem Cell Res Ther. 2 (6), (2011).
- Mae, S., et al. Monitoring and robust induction of nephrogenic intermediate mesoderm from human pluripotent stem cells. Nat Commun. 4, 1367 (2013).
