Assays für die Untersuchung der Rolle von Vitronectin in bakterielle Adhäsion und Serum-Widerstand
Summary
Dieser Bericht beschreibt die Protokolle für die Charakterisierung von Interaktionen zwischen bakteriellen äußeren Membranproteine und menschliche Ergänzung Regler Vitronectin. Die Protokolle können verwendet werden, um die Bindung Reaktionen und die biologische Funktion von Vitronectin in alle Bakterienarten zu studieren.
Abstract
Bakterien nutzen Ergänzung Regulatoren als Mittel zur Umgehung der Host Immunantwort. Hier beschreiben wir Protokolle für die Bewertung des Rolle Vitronectin Erwerbs bei der bakteriellen Zelle Oberfläche spielt im Widerstand gegen das Immunsystem des Wirts. Flow Cytometry Experimente identifiziert Humanplasma Vitronectin als Liganden für die bakterielle Rezeptor Außenmembran Protein H von Haemophilus Influenzae Typ f. Ein Enzym-linked Immunosorbentprobe-Assay wurde eingesetzt, um die Protein-Protein-Wechselwirkungen zwischen gereinigtes rekombinante Protein H und Vitronectin zu charakterisieren, und verbindliche Affinität wurde anhand Bio-Schicht Interferometrie. Die biologische Bedeutung der Bindung von Vitronectin an Protein H an der bakteriellen Zellenoberfläche in Umgehung der Wirt Immune Antwort bestätigte mit einem Serum-Widerstand-Assay mit normal- und Vitronectin erschöpft Humanserum. Die Bedeutung der Vitronectin in der bakterielle Haftfähigkeit war mit Glas-Objektträger mit und ohne Vitronectin Beschichtung, gefolgt von gramfärbung analysiert. Zu guter Letzt wurde bakterielle Adhäsion zur menschlichen alveoläre Epithelzelle Monolagen untersucht. Die hier beschriebenen Protokolle können die Studie von einer bakteriellen Spezies von Interesse leicht angepasst.
Introduction
Vitronectin (Vn) ist eine wichtige menschliche Glykoprotein Homöostase per Verordnung das fibrinolytische System beteiligt. VL fungiert auch als Regulator Ergänzung durch Hemmung des terminal Ergänzung Weges während der C5b6-7 Komplexbildung und C9 Polymerisation. Verschiedene bakterielle Krankheitserreger haben gezeigt, VL an der Zelloberfläche als Mittel der widerstehenden Ergänzung Ablagerung1,2,3zu rekrutieren. Darüber hinaus fungiert VL wie ein “Sandwich” Molekül zwischen Bakterien und Host epithelialen Zell-Rezeptoren, dadurch Förderung festhalten und Internalisierung von Krankheitserregern2,4,5. Bindung des Vn an der bakteriellen Zellenoberfläche wird durch andere derzeit nicht identifizierte Proteine vermittelt. Voll die funktionale Rolle der Vn-Bindung in Umgehung der Schlauch Immunantwort Aufklärung erfordert daher Identifizierung von Proteinen, VL-recruiting.
Der erste Schritt bei der Ermittlung von Vn-bindende Proteine ist zu prüfen, ob ein Erreger von Interesse gereinigten VL. Durchflusszytometrie binden kann eine bequeme und einfache Methode um festzustellen, ob VL Erreger Zellen gebunden ist. In dieser Studie untersuchten wir die Bindung von Vn an verschiedenen Haemophilus Influenzae Typ f (Hif) klinischen Isolaten6. Die hier beschriebene Methode ist quantitativ und kann verwendet werden, um die Bindungskapazität einer Vielzahl von Bakterienstämmen zu unterscheiden. In einer früheren Studie gekennzeichnet wir Protein H (PH) der Hif als Vn-bindende Protein7. Daher in der vorliegenden Studie das Vn-Bindung-Potenzial der Wildtyp (WT) Hif und Hif M10ΔLph Mutanten wurden verglichen mit den beschriebenen Protokollen.
Sobald festgestellt wird, dass ein Erreger Vn bindet, ist der zweite Schritt, die Oberfläche Proteom zu charakterisieren, um potenzielle Vn-bindende Proteine zu identifizieren. Eine Vielzahl von Ansätzen eignet sich für diesen Zweck8,9, aber diese Methoden sind nicht in diesem Bericht beschrieben. Die Methode am besten geeignet für die Untersuchung von Protein-Protein-Wechselwirkungen ist rekombinant express ausgewählte bakterielle Oberflächenproteine in E. Coli und reinigen durch Affinitätschromatographie. Hier verwenden wir PH und seine molekularen Wechselwirkung mit VL um die Methode zu veranschaulichen. Wechselwirkungen zwischen rekombinante PH und VL zeichneten sich mit einem Enzym-linked Immunosorbentprobe Assay (ELISA)7 und eine neu entwickelte markierungsfreie Technik bekannt als Bio-Schicht Interferometrie (BLI)10,11. Während ELISAs verwendet werden können, um Protein-Protein-Wechselwirkungen zu bestätigen, bietet BLI detaillierte Daten über die kinetischen Parameter der Interaktionen.
Um die funktionale Rolle der Vn in der bakterielle Haftfähigkeit zu studieren, können zwei verschiedene Tests genutzt werden. Der erste Test hier beschriebenen ist direkte Messung der bakteriellen Einhaltung der Vn-beschichtete Glasoberflächen, während der zweite Test festhalten an der Oberfläche der Epithelzellen untersucht. Für den ersten Test Glas-Objektträger wurden mit VL beschichtet, und die Bindung von WT oder mutierten Hif Stämme wurde durch gramfärbung und Mikroskopie beurteilt. Diese Technik unterscheidet leicht Bakterien basiert auf der Fähigkeit, VL12binden. Bakterielle Adhäsion für Säugerzellen war dann analysiert, durch Zugabe von kultivierten Bakterien auf einem monomolekularen Film der Typ II alveolären Epithelzellen; bakterielle Anlage wurde beurteilt durch zählen der Anzahl der koloniebildenden Einheiten (KBE). Eingehalten und internalisierte Bakterien können in das Vorhandensein oder Fehlen von VL4,13unterschieden werden.
Die Rolle der Vn-Akquisition im bakteriellen Serum Widerstand wurde mit einem Serum Tötung Assay (d.h. Serum bakterizide Aktivität) ausgewertet. Um die Bedeutung der Vn-Akquisition im Serum Widerstand zu beurteilen, wurde die bakterizide Aktivität von Vn-abgereicherte Serum (VDS) mit der normalen menschlichen Serum (NHS) verglichen. Die Methode leicht unterscheidet Vn-Bindung im Vergleich zu nicht-bindenden Bakterien anhand Serum Widerstand. Wir haben diese Methode zur Untersuchung der Rolle der Vn im Serum Widerstand von einigen bakteriellen Krankheitserregern4,12verwendet.
Zahlreiche Methoden wurden für die Untersuchung von Wirt-Pathogen Interaktionen beschrieben. Hier beschreiben wir eine Reihe von Protokollen, die für die Untersuchung von jeder Erreger leicht angepasst werden kann, um die Rolle der Vn in der Pathogenese zu bewerten. Wir testeten diese Protokolle mit verschiedenen Krankheitserregern und Hif wurde gewählt als Beispiel für diesen Bericht.
Protocol
Representative Results
Discussion
Bakterielle Krankheitserreger rekrutieren Vn an der Zelloberfläche und Ergänzung der Regler zur Verhinderung der Ablagerung von Komplementfaktoren und Fertigstellung der Membrane Angriff Komplex2zu nutzen. VL fungiert auch als eine Brücke Molekül zwischen bakteriellen Oberflächenproteine und Host-Zell-Oberfläche Rezeptoren, so dass Krankheitserreger an der Oberfläche der Epithelzellen haften und anschließend vermitteln Verinnerlichung. In dieser Studie beschreiben wir Protokolle, die verwe…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Diese Arbeit wurde unterstützt durch Zuschüsse der Stiftung Anna und Edwin Berger, Lars Hierta, O.E und Edla Johansson Stiftung, dem schwedischen Medical Research Council (gewähren Nummer K2015-57 X-03163-43-4, www.vr.se), der Krebs-Stiftung an der Universität Krankenhaus in Malmö, die Physiographische Gesellschaft (Forssman Stiftung) und Skåne County Council Research and Development Foundation.
Materials
| 1.5 mL thermomixter | Eppendorf | 5355 | dry block heating and cooling shaker |
| 5 mL polystyrene round-bottom tube | BD Falcon | 60819-138 | 12 × 75 mm style |
| 5% CO2 supplied incubator | Thermo Scientific | BBD6220 | |
| 6 mL polystyrene round-bottom tube | VWR | 89000-478 | 12 × 75 mm style with cap |
| 24-well plates | BD Falcon | 08-772-1H | Cell culture grade |
| 30% Hydrogen peroxide (H2O2) solution | Sigma-Aldrich | H1009-100ML | Laboratory analysis grade |
| 75 cm2 tissue culture flask | BD Falcon | BD353136 | Vented |
| 96 well black flat bottom plate | Greiner Bio-One | 655090 | Tissue culture treated µClear black plates |
| A549 Cell Line human | Sigma-Aldrich | 86012804-1VL | |
| Cell detachment enzyme (Accutase) | Sigma-Aldrich | A6964-500ML | Cell Culture Grade |
| AR2G sensors | Pall Life Science | 18-5095 | Sensor to immobilized protein by amino coupling |
| Acetone | VWR | 97064-786 | Analysis grade |
| Bovine Serum Albumins (BSA) | Sigma-Aldrich | A2058 | Suitable for cell culture |
| Bibulous paper | VWR | 28511-007 | |
| Bio-layer interferometer | Pall Life Science | FB-50258 | Bilayer interferometry measuring equipment |
| Crystal violet solution | Sigma-Aldrich | HT90132-1L | |
| C4BP (C4b binding protein) | Complement Technology, Inc. | A109 | Bought as Frozen liquid form |
| Calcium chloride (CaCl2) | Sigma-Aldrich | C5670-500G | |
| Carbol-fuchsin solution | Sigma-Aldrich | HT8018-250ML | |
| Citric acid | Sigma-Aldrich | 251275-500G | American Chemical Society (ACS) grade |
| Decolorizing solution | Sigma-Aldrich | 75482-250ML-F | |
| E. coli host (E. Coli BL21) | Novagen | 69450-3 | Protein expression host |
| F12 medium | Sigma-Aldrich | D6421 | Cell Culture Grade |
| Flow cytometer | BD Biosciences | 651154 | Cell analysis grade for research applications |
| Fetal Calf Serum (FCS) | Sigma-Aldrich | 12003C | Suitable for cell culture |
| Normal human serum (NHS) | Complement Technology, Inc. | NHS | Pooled human serum |
| FITC-conjugated donkey anti-sheep antibodies | AbD Serotec | STAR88F | Polyclonal |
| Gentamicin | Sigma-Aldrich | G1397 | Cell culture grade |
| Glucose | Sigma-Aldrich | G8270-1KG | |
| Gelatin | Sigma-Aldrich | G9391 | Suitable for cell culture |
| Hemocytometer | Marienfeld | 640210 | |
| HRP-conjugated anti-His tag antibodies | Abcam | ab1269 | Polyclonal |
| Human factor H | Complement Technology, Inc. | A137 | Bought as Frozen liquid form |
| C4BP | Complement Technology, Inc. | A109 | Frozen solution |
| Human serum albumin | Sigma-Aldrich | A1653-10G | lyophilized powder |
| Histidine affinity resin column (HisTrap HP) | GE Health Care Life Science | 17-5247-01 | Columns prepacked with Ni Sepharose |
| His-tagged PH | Recombinantly expressed and purified in our lab | ||
| Iodine solution | Sigma-Aldrich | HT902-8FOZ | |
| Methanol | VWR | BDH1135-1LP | Analysis grade |
| Microscope | Olympus | IX73 | Inverted microscope |
| Microscope slides | Sigma-Aldrich | S8902 | plain, size 25 mm × 75 mm |
| Magnesium chloride (MgCl2) | Sigma-Aldrich | M8266-1KG | |
| Plasmid containg C terminal 6x His-tag on the backbone (pET26(b)) | Novagen | 69862-3 | DNA vector |
| Polysorb microtitre plates | Sigma-Aldrich | M9410 | For ELISA |
| Potassium hydroxide (KOH) | Sigma-Aldrich | 6009 | American Chemical Society (ACS) grade |
| Sheep anti-human Vn antibodies | AbD Serotec | AHP396 | Polyclonal |
| Shaker | Stuart Scientific | STR6 | Platform shaker |
| Tissue culture flask | BD Falcon | 3175167 | 75 cm2 |
| Thermomixer | Sigma-Aldrich | T3317 | Dry block heating and cooling shaker |
| Tetramethylbenzidine | Sigma-Aldrich | 860336-100MG | ELISA grade |
| Vitronectin (Vn) from human plasma | Sigma-Aldrich | V8379-50UG | cell culture grade |
Referências
- Singh, B., Su, Y. C., Riesbeck, K. Vitronectin in bacterial pathogenesis: a host protein used in complement escape and cellular invasion. Mol. Microbiol. 78 (3), 545-560 (2010).
- Hallstrom, T., et al. Conserved Patterns of Microbial Immune Escape: Pathogenic Microbes of Diverse Origin Target the Human Terminal Complement Inhibitor Vitronectin via a Single Common Motif. PloS one. 11 (1), 0147709 (2016).
- Su, Y. C., Hallstrom, B. M., Bernhard, S., Singh, B., Riesbeck, K. Impact of sequence diversity in the Moraxella catarrhalis. UspA2/UspA2H head domain on vitronectin binding and antigenic variation. Micro. Infect. 15 (5), 375-387 (2013).
- Singh, B., et al. A fine-tuned interaction between trimeric autotransporter haemophilus surface fibrils and vitronectin leads to serum resistance and adherence to respiratory epithelial cells. Infect. Immun. 82 (6), 2378-2389 (2014).
- Kohler, S., et al. Binding of vitronectin and Factor H to Hic contributes to immune evasion of Streptococcus pneumoniae. serotype 3. Thromb. haemostasis. 113 (1), 125-142 (2015).
- Onelli, E., Citterio, S., O’Connor, J. E., Levi, M., Sgorbati, S. Flow cytometry, sorting and immunocharacterization with proliferating cell nuclear antigen of cycling and non-cycling cells in synchronized pea root tips. Planta. 202 (2), 188-195 (1997).
- Al-Jubair, T., et al. Haemophilus influenzae Type f Hijacks Vitronectin Using Protein H To Resist Host Innate Immunity and Adhere to Pulmonary Epithelial Cells. J. Immunol. 195 (12), 5688-5695 (2015).
- Martinez-Martin, N. Technologies for Proteome-Wide Discovery of Extracellular Host-Pathogen Interactions. J. Immunol. Res. 2017, 2197615 (2017).
- Boleij, A., Laarakkers, C. M., Gloerich, J., Swinkels, D. W., Tjalsma, H. Surface-affinity profiling to identify host-pathogen interactions. Infect. Immun. 79 (12), 4777-4783 (2011).
- Abdiche, Y., Malashock, D., Pinkerton, A., Pons, J. Determining kinetics and affinities of protein interactions using a parallel real-time label-free biosensor, the Octet. Anal. Biochem. 377 (2), 209-217 (2008).
- Sultana, A., Lee, J. E. Measuring protein-protein and protein-nucleic Acid interactions by biolayer interferometry. Cur. Prot. Prot. Sc. 79, 11-26 (2015).
- Su, Y. C., et al. Haemophilus influenzae acquires vitronectin via the ubiquitous Protein F to subvert host innate immunity. Mol. Microbiol. 87 (6), 1245-1266 (2013).
- Ronander, E., et al. Nontypeable Haemophilus influenzae adhesin protein E: characterization and biological activity. J. Infect. Dis. 199 (4), 522-531 (2009).
- Sezonov, G., Joseleau-Petit, D., D’Ari, R. Escherichia coli physiology in Luria-Bertani broth. J. Bact. 189 (23), 8746-8749 (2007).
- Fleury, C., et al. Identification of a Haemophilus influenzae factor H-Binding lipoprotein involved in serum resistance. J. Imunol. 192 (12), 5913-5923 (2014).
- Abdiche, Y., Malashock, D., Pinkerton, A., Pons, J. Determining kinetics and affinities of protein interactions using a parallel real-time label-free biosensor, the Octet. Anal. Biochem. 377 (2), 209-217 (2008).
- Rich, R. L., Myszka, D. G. Higher-throughput, label-free, real-time molecular interaction analysis. Anal. Biochem. 361 (1), 1-6 (2007).
- McNamara, G., Difilippantonio, M. J., Ried, T. Microscopy and image analysis. Current protoc. Hum. Genet. , 4 (2005).
- Lieber, M., Smith, B., Szakal, A., Nelson-Rees, W., Todaro, G. A continuous tumor-cell line from a human lung carcinoma with properties of type II alveolar epithelial cells. International J. Canc. 17 (1), 62-70 (1976).
- Foster, K. A., Oster, C. G., Mayer, M. M., Avery, M. L., Audus, K. L. Characterization of the A549 cell line as a type II pulmonary epithelial cell model for drug metabolism. Exp. Cell Res. 243 (2), 359-366 (1998).
- Su, Y. C., et al. Haemophilus influenzae P4 Interacts With Extracellular Matrix Proteins Promoting Adhesion and Serum Resistance. J. Infect. Dis. 213 (2), 314-323 (2016).
- Singh, B., Al-Jubair, T., Morgelin, M., Thunnissen, M. M., Riesbeck, K. The unique structure of Haemophilus influenzae protein E reveals multiple binding sites for host factors. Infect. Immun. 81 (3), 801-814 (2013).
- Vellaiswamy, M., Campagna, B., Raoult, D. Transmission electron microscopy as a tool for exploring bacterial proteins: model of RickA in Rickettsia conorii. New Microbiolog. 34 (2), 209-218 (2011).
- Pinne, M., Haake, D. Immuno-fluorescence assay of leptospiral surface-exposed proteins. J. Vis. Exp. JoVE. (53), (2011).
