Avancée Modèle animal de colorectal métastatique du foie: Techniques d'imagerie et propriétés des métastatiques Clones
Summary
The ability of metastatic clones to colonize distant sites depends on their proliferation capacity and/or their ability to survive in the host microenvironment without significant proliferation. Here, we present an animal model that allows quantitative visualization of both types of liver colonization by metastatic clones.
Abstract
Les patients ayant un nombre limité de métastases hépatiques et de faibles taux de progression peuvent être traités avec succès avec le traitement local des approches 1,2. Cependant, on sait peu sur l'hétérogénéité des métastases hépatiques, et des modèles animaux capables d'évaluer le développement des colonies métastatiques individuels sont nécessaires. Ici, nous présentons un modèle avancé de métastases hépatiques qui permet de visualiser l'évolution quantitative de clones individuels de la tumeur dans le foie et l'estimation de leur cinétique de croissance et l'efficacité de la colonisation. Nous avons généré un panel de dérivés monoclonaux de HCT116 cellules cancéreuses colorectales humaines stablement marquées avec la luciférase et tdTomato et possédant des propriétés de croissance. Avec une injection splénique suivie d'une splénectomie, la majorité de ces clones sont capables de générer des métastases hépatiques, mais avec des fréquences différentes de la colonisation et les différents taux de croissance. Utilisation du Syste In Vivo Imagingm (IVIS), il est possible de visualiser et de quantifier le développement de métastases avec luminescente in vivo et ex vivo de l' imagerie de fluorescence. En outre, Diffuse luminescentes imagerie par tomographie (en DLIT) fournit une distribution 3D des métastases hépatiques in vivo. Ex vivo imagerie de fluorescence des foies prélevés fournit des mesures quantitatives des colonies métastatiques hépatiques individuels, ce qui permet l'évaluation de la fréquence de la colonisation du foie et de la cinétique de croissance des métastases. Étant donné que le modèle est similaire à des métastases hépatiques cliniquement observés, il peut servir en tant que modalité pour détecter les gènes associés à des métastases du foie et pour tester des traitements ablatifs ou un adjuvant potentiel pour une maladie métastatique du foie.
Introduction
Les patients présentant des métastases hépatiques de cancers colorectaux primaires (CRC) sont caractérisés par un mauvais pronostic. Le taux de survie à 5 ans pour les primaires non métastatiques CRC (stades I – III) est estimée à 75-88% 3,4, alors que les patients présentant des métastases hépatiques (stade IV) ont un taux de survie à 5 ans de seulement 8 – 12% 5 , 6. Cependant, les patients métastatiques constituent un groupe hétérogène, présentant des nombres différents de métastases et des temps de récurrence. Les observations cliniques indiquent que le nombre de métastases (qui peut être proportionnelle à la capacité de coloniser ou de la fréquence de la colonisation) et la taille d'une métastase unique (proportionnelle au taux de croissance locale) sont des facteurs pronostiques indépendants 1,7. En d'autres termes, le succès des clones métastatiques colonisent le foie dépend de deux propriétés principales: leur capacité à croître et à leur capacité à diffuser et à survivre dans le microenvironnement du foie.
La conceptiondes modèles cliniques réussis avec la capacité de capturer et de quantifier les propriétés des clones métastatiques peut considérablement améliorer notre compréhension des métastases hépatiques biologie et de fournir un outil efficace pour la conception d'approches thérapeutiques potentielles. Les modèles de métastases hépatiques expérimentales ont été précédemment rapporté 8,9, mais aucun d'entre eux à condition que la capacité de capturer et de décrire les propriétés des clones individuels métastatiques in vivo et ex vivo quantitativement.
Ici, nous présentons un nouveau modèle avancé de métastases hépatiques qui comprend la génération de clones tumoraux avec des efficacités différentes de colonisation du foie et des propriétés de croissance. Nous avons employé une combinaison de double marquage des cellules cancéreuses avec la luciférase et la protéine fluorescente tdTomato avec la génération de lignées cellulaires monoclonales qui ont des différences intrinsèques de la capacité métastatique. Dans ce modèle expérimental, les données indiquent que le développement dedes métastases hépatiques peuvent être décrits en termes de fréquence de la colonisation et le temps de doublement (Td), ce qui est cohérent avec les observations cliniques. La nature quantitative de ce modèle rend facilement adoptable pour la découverte de médicaments et à des fins de diagnostic.
Protocol
Representative Results
Discussion
Le modèle animal présenté dans le rapport actuel est basé sur deux grandes approches. Tout d' abord, afin d'assurer la capacité d'observer des clones métastatiques avec des propensions différentes à coloniser et proliférer dans le foie, un panel de lignées très hétérogènes de cellules monoclonaux a été établie, plutôt que d' un cancer non fractionnée lignée cellulaire établie 12,13. L'approche monoclonal pour le développement de métastases est justifiée par des donn…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Nous tenons à remercier le Dr Geoffrey L. Greene (Université de Chicago) pour le plasmide luc2-tdTomato et la lignée cellulaire HCT116, M. Ani Solanki (Centre des ressources animales) pour la gestion de la souris, et le Dr Lara Leoni pour l'assistance avec le DLIT. Quantifications des intensités de fluorescence et de luminescence ont été réalisées dans l'imagerie des ressources de recherche intégrée des petits animaux à l'Université de Chicago sur un spectre IVIS (PerkinElmer, Hopkinton, MA). Ce travail a été soutenu par la Virginie et Fonds Ludwig DK for Cancer Research, la Fondation du cancer du poumon de la recherche (LCRF), la Fondation du cancer de la prostate (PCF), et le Centre de soutien Grant Cancer (P30CA014599). Les bailleurs de fonds ont joué aucun rôle dans la conception de l'étude, la collecte de données et l'analyse, la décision de publier, ou de la préparation du manuscrit.
Materials
| IVIS Spectrum In Vivo Imaging System | Caliper Life Sciences | 124262 | In vivo imaging system |
| LivingImage 4.0 Software | Caliper Life Sciences | 128165 | Imaging software |
| VAD-MGX Research Anesthetic Machine | Vetamac | VAD-MGX | Inhalation anesthesia machine |
| DMEM | Gibco | 11965-118 | Cell culture reagents |
| DPBS | Gibco | 14190250 | Cell culture reagents |
| Penicillin-Streptomycin, liquid (10,000 units penicillin;10,000 μg streptomycin) | Invitrogen | 15140163 | Cell culture reagents |
| HBSS | ThermoFisher | 24020117 | Cell culture reagents |
| Buprenex Injection (0.3mg/mL) | Reckitt Benckiser Healthcare Ltd. | 12496-0757-5 | Buprenorphine hydrochloride |
| Gemini Cautery System | Braintree Scientific | GEM 5917 | Hand-held cautery for splenectomy |
| Micro Clip; Straight; 70 Grams Pressure; 1.5mm Clip Width; 10mm Jaw Length | Roboz Surgical Instrument | RS-5426 | Hemoclip: Hemostasis instruments after spleen injection |
| D-luciferin, potassium salt | Goldbio Technology | LUCK-1G | Luciferin potassium salt |
| Opti-MEM I Reduced Serum Medium | Gibco | 31985062 | Reduced Serum Medium |
| TC20 Automated Cell Counter | BIO-RAD | 1450102 | Automatic cell counter |
| JMP10 software | SAS Institute | Data analysis software | |
| BD FACSAria II cell sorter | BD Biocsiences | Cell sorter |
Referências
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