Avanzada modelo animal de colorrectal metástasis en hígado: Técnicas de imagen y propiedades metastásicas de los clones
Summary
The ability of metastatic clones to colonize distant sites depends on their proliferation capacity and/or their ability to survive in the host microenvironment without significant proliferation. Here, we present an animal model that allows quantitative visualization of both types of liver colonization by metastatic clones.
Abstract
Los pacientes con un número limitado de metástasis hepáticas y bajas tasas de progresión pueden ser tratados con éxito con el tratamiento local se aproxima a 1,2. Sin embargo, poco se sabe acerca de la heterogeneidad de las metástasis hepáticas, y se necesitan modelos animales capaces de evaluar el desarrollo de las colonias metastásicas individuales. A continuación, presentamos un modelo avanzado de las metástasis hepáticas que proporciona la capacidad de visualizar cuantitativamente el desarrollo de clones individuales del tumor en el hígado y estimar su cinética de crecimiento y la eficiencia de la colonización. Hemos generado un panel de derivados monoclonales de células de cáncer colorrectal humano HCT116 de forma estable con la etiqueta luciferasa y tdTomato y que poseen diferentes propiedades de crecimiento. Con una inyección esplénica seguido de una esplenectomía, la mayoría de estos clones son capaces de generar metástasis hepáticas, pero con diferentes frecuencias de la colonización y diferentes tasas de crecimiento. Uso de la Syste In Vivo Imagingm (IVIS), es posible visualizar y cuantificar el desarrollo de metástasis con luminiscente in vivo y ex vivo de imagen fluorescente. Además, Diffuse luminiscentes tomografía (DLIT) proporciona una distribución 3D de las metástasis hepáticas in vivo. Ex vivo de imágenes de fluorescencia de hígados cosechadas proporciona mediciones cuantitativas de colonias metastásicas hepáticas individuales, lo que permite la evaluación de la frecuencia de colonización hígado y la cinética de crecimiento de metástasis. Puesto que el modelo es similar a metástasis hepáticas clínicamente observados, puede servir como una modalidad para la detección de genes asociados a metástasis de hígado y para probar posibles tratamientos ablativos o adyuvante para la enfermedad metastásica de hígado.
Introduction
Los pacientes con metástasis hepáticas de los cánceres primarios de colon (CRC) se caracterizan por un mal pronóstico. La tasa de supervivencia a 5 años para los primarios no metastásicos CRC (estadios I – III) se estima en un 75 – 88% 3,4, mientras que los pacientes con metástasis hepáticas (estadio IV) tienen una tasa de supervivencia a 5 años de sólo el 8 – 12% 5 , 6. Sin embargo, los pacientes metastásicos representan un grupo heterogéneo presentando con diferente número de metástasis y recurrencia diferentes momentos. Las observaciones clínicas indican que el número de metástasis (que puede ser proporcional a la capacidad de colonización o la frecuencia de colonización) y el tamaño de cualquier metástasis única (proporcional a la tasa de crecimiento local) son factores pronósticos independientes 1,7. En otras palabras, el éxito de clones metastásicos que colonizan el hígado depende de dos propiedades principales: su capacidad para crecer y su capacidad para difundir y sobrevivir en el microambiente de hígado.
El diseñode modelos clínicos exitosos con la capacidad de capturar y cuantificar las propiedades de clones metastásicos puede mejorar drásticamente nuestra comprensión de la biología del hígado metástasis y proporcionar una herramienta eficaz para el diseño de posibles enfoques terapéuticos. Modelos de metástasis hepática experimental se ha informado anteriormente 8,9, pero ninguno de ellos siempre que la capacidad de capturar y describir las propiedades de clones metastásicas individuales tanto in vivo como ex vivo cuantitativamente.
A continuación, presentamos un nuevo modelo, avanzada de la metástasis hepática que incluye la generación de clones tumorales con diferentes eficiencias de colonización del hígado y propiedades de crecimiento. Empleamos una combinación de de doble etiquetado de las células cancerosas con la luciferasa y la proteína fluorescente tdTomato con la generación de líneas de células monoclonales que tienen diferencias intrínsecas en la capacidad metastásica. En este modelo experimental, los datos indican que el desarrollo demetástasis hepáticas pueden ser descritos en términos de frecuencia de colonización y el tiempo de duplicación (Td), que es coherente con las observaciones clínicas. La naturaleza cuantitativa de este modelo hace que sea fácil adopción para el descubrimiento de fármacos y diagnóstico.
Protocol
Representative Results
Discussion
El modelo animal presentado en el informe actual se basa en dos enfoques principales. En primer lugar, a fin de garantizar la capacidad de observar clones metastásicos con diferentes propensiones a colonizar y proliferar en el hígado, se estableció un panel de líneas celulares monoclonales altamente heterogéneos, en lugar de una línea celular de cáncer no fraccionada establecido 12,13. El enfoque monoclonal para el desarrollo de la metástasis es justificado por los datos genómicos últimos 14</s…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Nos gustaría agradecer al Dr. Geoffrey L. Greene (Universidad de Chicago) para el plásmido Luc2-tdTomato y la línea celular HCT116, el Sr. Solanki Ani (Centro de Recursos de animales) para la gestión de los ratones, y el Dr. Lara Leoni por la asistencia con la DLIT. Cuantificaciones de intensidades fluorescentes y luminiscentes se realizaron en la Investigación de Recursos de imagen Pequeños Animales integrada en la Universidad de Chicago en un espectro IVIS (PerkinElmer, Hopkinton, MA). Este trabajo fue apoyado por el Fondo de Virginia y DK Ludwig para la Investigación del Cáncer, la Fundación de Investigación de Cáncer de Pulmón (LCRF), la Fundación de Cáncer de Próstata (PCF), y el Centro de soporte de Grant Cáncer (P30CA014599). Los proveedores de fondos no tiene función alguna en el diseño del estudio, la recogida de datos y análisis, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito.
Materials
| IVIS Spectrum In Vivo Imaging System | Caliper Life Sciences | 124262 | In vivo imaging system |
| LivingImage 4.0 Software | Caliper Life Sciences | 128165 | Imaging software |
| VAD-MGX Research Anesthetic Machine | Vetamac | VAD-MGX | Inhalation anesthesia machine |
| DMEM | Gibco | 11965-118 | Cell culture reagents |
| DPBS | Gibco | 14190250 | Cell culture reagents |
| Penicillin-Streptomycin, liquid (10,000 units penicillin;10,000 μg streptomycin) | Invitrogen | 15140163 | Cell culture reagents |
| HBSS | ThermoFisher | 24020117 | Cell culture reagents |
| Buprenex Injection (0.3mg/mL) | Reckitt Benckiser Healthcare Ltd. | 12496-0757-5 | Buprenorphine hydrochloride |
| Gemini Cautery System | Braintree Scientific | GEM 5917 | Hand-held cautery for splenectomy |
| Micro Clip; Straight; 70 Grams Pressure; 1.5mm Clip Width; 10mm Jaw Length | Roboz Surgical Instrument | RS-5426 | Hemoclip: Hemostasis instruments after spleen injection |
| D-luciferin, potassium salt | Goldbio Technology | LUCK-1G | Luciferin potassium salt |
| Opti-MEM I Reduced Serum Medium | Gibco | 31985062 | Reduced Serum Medium |
| TC20 Automated Cell Counter | BIO-RAD | 1450102 | Automatic cell counter |
| JMP10 software | SAS Institute | Data analysis software | |
| BD FACSAria II cell sorter | BD Biocsiences | Cell sorter |
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