En enkel mekanisk prosedyre for å opprette limbale Stem Cell Mangel på Mouse

Summary

Den følgende artikkelen gir en enkel, reproduserbar teknikk for effektivt å skape en bærekraftig musemodell for limbale stamcellemangel (LSCD). Denne dyremodell er nyttig i å teste og sammenligne effekten av behandlinger for limbale stamcellesykdommer.

Abstract

Limbale stamcellemangel (LSCD) er en tilstand av funksjonsfeil eller tap av limbale epiteliale stamceller, hvoretter cornealepitelets er erstattet med conjunctiva. Pasienter lider av tilbakevendende korneadefekter, smerte, betennelse og tap av syn.

Tidligere har en murin modell av LSCD ble beskrevet og sammenlignet med to andre modeller. Målet var å frembringe en konsistent musemodell for LSCD at begge etterligner den fenotype hos mennesker og varer lenge nok til å gjøre det mulig å studere sykdom patofysiologien og å vurdere nye behandlinger. Her blir den teknikk som er beskrevet i mer detalj.

En motorisert redskap med en roterende graden er konstruert for å fjerne rust ringene fra hornhinneoverflaten eller å jevne pterygium sengen hos pasienter. Det er en egnet innretning for å skape den ønskede LSCD modell. Det er en lett tilgjengelig, lett-å-bruke verktøy med en fin spiss som gjør det hensiktsmessig for å arbeide på små øyne, somi mus. Sin søknad hindrer unødvendig traume for øyet, og det resulterer ikke i uønskede skader, som ofte er tilfellet med kjemiske skademodeller. I motsetning til en sløv skraper, fjerner det epitel med basalmembranen. I denne protokollen ble limbale området slipes to ganger, og deretter hele cornealepitelets ble barbert fra limbus til limbus. For å unngå stroma skade, omsorg ble tatt ikke å børste hornhinnen overflaten når Epitel er allerede fjernet.

Introduction

Cornealepitelets er nødvendig for å opprettholde klarheten og integriteten av hornhinnen. Det er stadig fornyes gjennom hele livet av epithelial stamceller bosatt i limbus-en smal sone i krysset av hornhinnen og konjunktiva. Disse selvfornyende limbale stamceller spille en avgjørende rolle i å regenerere cornealepitelets, både normalt og etter skade. Delvis eller fullstendig nedbryting av disse stamcellene vil resultere i tilbakevendende hornhinnen erosjoner, smerte, hornhinnen arrdannelse og neovaskularisering, utseende av slimceller, og hvis den forblir ubehandlet, korneal blindhet. Denne tilstanden er kjent som limbale stamcelle-mangel (LSCD) og kan være idiopatisk; arvelig; eller ervervet på grunn av kjemiske eller termiske skader, langsiktig bruk av kontaktlinser, og kronisk betennelse ^1-6.

Forskning på LSCD krever en passende dyremodell som ikke bare etterligner sykdom hos mennesker, men er reproduserbar og bærekraftig, med minst enmount for skade på andre hornhinnen og okulære strukturer. Denne modellen er nødvendig for å vurdere behandling og for å avklare sykdomsmekanismene ved molekylære og cellulære nivåer. Som beskrevet før ^1, med bruk av en roterende graden, kan man lett utvikle en musemodell for LSCD som har de nevnte fordeler og vedvarer i minst tre måneder. Målet med denne studien er å presentere en enkel, reproduserbar og bærekraftig musemodell for LSCD.

Den roterende Burr er et hendig verktøy som jevnt fjerner epitel uten å skade den underliggende stroma ^en. Det har blitt brukt til å indusere sentral korneal erosjon ^{7, 8} i sårheling studier. Den herved presentert teknikk for å skape LSCD i en mus har ikke blitt rapportert før. Tidligere innført fremgangsmåter for skraping av epitel med et stump spatel resultere i en mindre ensartet skadefri spesielt ved limbus-og en mer variabel fenotype ^{1, 9,} med mer restaurering of normal cornealepitelets ^en. I motsetning til den butte skraper fjerner den roterende graden epiteliale basalmembranen, så vel ^{7, 8, 10.} Andre rapporterte fremgangsmåter for å kutte stamceller innebære bruk av kjemikalier, slik som natrium-hydroksid, n-heptanol, og benzalkoniumklorid, som ikke bare kan forårsake uønsket skade på underliggende øyet strukturer, men også kan føre til betydelige betennelse og påfølgende korneal opasitet eller epitel plateepitel metaplasi ^11-15. Den roterende Burr er ikke forbundet med disse alvorlige komplikasjoner. Kirurgisk fjerning av limbale epitel, alene eller sammen med bruk av kjemikalier ^{10, 11, 16,} er mer vanskelig å utføre og er ikke det beste alternativet i dyr med små øyne og en tynn limbale epitel (for eksempel mus). I tillegg overraskende, limbectomy kan fortsatt la noen av limbale epitel bak ^10.

Den nedenfor beskrevne teknikken vil resultere i LSCD med neovascularization end conjunctivalization som etterligner presentasjonen av komplett LSCD hos pasienter og varer i minst tre måneder ^1. Det passer for de som ønsker å studere LSCD eller sårtilheling patofysiologi, immunologi, og potensielle behandlinger hos mus. Muligens, med noen modifikasjoner, denne fremgangsmåten kan bli utført på rotter eller kaniner ^10. Ettersom den roterende graden effektivt fjerner epitel, kan den anvendes i hvilken som helst forskning vedrørende korneal epitelial abrasjon / såret og i andre relaterte behandling eller molekylærbiologiske undersøkelser.

Protocol

Alle prosedyrer utført på dyr i samsvar med Foreningen for forskning i Vision og Oftalmologi regnskap for bruk av dyr i et syn forskning. Fjorten fire til seks måneder gamle mannlige / kvinnelige C57BL / 6J villtype mus ble brukt: ti mus for skaden modell og fire som kontrolldyrene (unwounded hornhinner). 1. Animal Forberedelse Bedøve en mus med en intraperitoneal injeksjon av 100 mg / kg ketamin og 5 mg / kg xylazin blanding. Etter at bedøvelsen har virket, klype tå for å …

Representative Results

Innen en måned etter å ha utført denne teknikken, 100% av hornhinner utviklet overfladisk neovaskularisering (figur 1A. Bildene ble tatt med et kamera koblet til en spaltelampe under et sterkt felt og koboltblått filter). I 18/20 (90%) av øynene, er involvert neovaskularisering hele hornhinneoverflaten (figur 1A). I 2/20 (10%), ble neovascularization observert i tre av fire hornhinnen kvadranter, men det fortsatt nådde hornhinnen sentrum. <p cl…

Discussion

Denne artikkelen beskriver en reproduserbar og relativt enkel teknikk for å skape en musemodell for LSCD. Det er flere viktige aspekter ved denne modellen som er verdt å merke seg. Først, i motsetning til modeller som bruker kjemikalier ^{11, 12,} skaden innebærer først og fremst overflaten epitel (og basalmembran), med minimal skade på den underliggende hornhinnen stroma eller andre intraokulære strukturer. Det er således bare begrenset inflammasjon og arrdannelse, som begge kan komplisere prosessen og …

Materials

Rotating burr: AlgerBrush II rust ring remover	Rumex International Co, Clearwater, FL	16-141	0.5 mm burr. Also available from other companies.
Surgical microscope	Wild Heerbrugg, Switzerland	Wild M691
Digital camera	Nikon, Thailand
Nikon FS-2 slit lamp	Nikon, Japan
Polyclonal anti-CK12 antibody	Santa Cruz Blotechnology, CA,	SC-17101	1:100 concentration
Monoclonal anti-CK8 antibody	TROMA-I-s, Iowa City, IA	AB_531826	1:50 concentration