الخلايا الدبقية الصغيرة بمثابة جهاز الاستشعار البيولوجي الأب البديل لتحديد الجسيمات النانوية العصبية
Summary
Microglia (immune cells of the brain), are used as a surrogate biosensor to determine how nanoparticles influence neurotoxicity. We describe a series of experiments designed to assay microglial response to nanoparticles and exposure of hypothalamic neurons to supernatant from activated microglia to determine neurotoxicity.
Abstract
Nanoparticles found in air pollutants can alter neurotransmitter profiles, increase neuroinflammation, and alter brain function. Therefore, the assay described here will aid in elucidating the role of microglia in neuroinflammation and neurodegenerative diseases. The use of microglia, resident immune cells of the brain, as a surrogate biosensor provides novel insight into how inflammatory responses mediate neuronal insults. Here, we utilize an immortalized murine microglial cell line, designated BV2, and describe a method for nanoparticle exposure using silver nanoparticles (AgNPs) as a standard. We describe how to expose microglia to nanoparticles, how to remove nanoparticles from supernatant, and how to use supernatant from activated microglia to determine toxicity, using hypothalamic cell survival as a measure. Following AgNP exposure, BV2 microglial activation was validated using a tumor necrosis factor alpha (TNF-α) enzyme linked immunosorbent assay (ELISA). The supernatant was filtered to remove the AgNP and to allow cytokines and other secreted factors to remain in the conditioned media. Hypothalamic cells were then exposed to supernatant from AgNP activated microglia and survival of neurons was determined using a resazurin-based fluorescent assay. This technique is useful for utilizing microglia as a surrogate biomarker of neuroinflammation and determining the effect of neuroinflammation on other cell types.
Introduction
التلوث البيئي، وتحديدا تلك التي جسيمات متناهية الصغر (NP) مجموعة (1 – 20 نانومتر القطر)، وقد تم ربط السمنة وغيرها من الأمراض العصبية بسبب القدرة على عبور حاجز الدم في الدماغ 1-3. التعرض المرتفع للتلوث قد تحفز التهاب في الجهاز العصبي المركزي بما في ذلك منطقة ما تحت المهاد 1. واحد آلية المحتملة التي يحدث هذا يمكن أن يكون من خلال جسيمات متناهية الصغر التي يسببها تفعيل الخلايا الدبقية الصغيرة (الدماغ الخلايا المناعية) 4. وقد استخدمت الدراسات السابقة في النماذج الحية لدراسة آثار تلك المصادر على صحة الدماغ والتي تستغرق وقتا طويلا، ومكلفة، ولا تجيب بشكل مباشر على سؤال عن كيفية التأثير على مصادر القدرة النووية الخلايا الدبقية الصغيرة. الخلايا الدبقية الصغيرة تلعب دورا متعدد الأوجه في الجهاز العصبي المركزي، بما في ذلك صيانة المكروية الدماغ والتواصل مع توضيح الخلايا العصبية عن طريق الإفراج عن عوامل يفرز والسيتوكينات. اعتمادا على المحفزات، الخلايا الدبقية الصغيرة يمكن تفعيلها لالعلاقات العامة M1س للالتهابات أو دولة M2 المضادة للالتهابات. على سبيل المثال، تنشيط الخلايا الدبقية الصغيرة M1 تطلق السيتوكينات الموالية للالتهابات مثل عامل نخر الورم ألفا (TNF-α)، في حين تفعيلها M2 إطلاق الخلايا الدبقية الصغيرة السيتوكينات المضادة للالتهابات بما في ذلك انترلوكين 4 (IL-4). للتحقق من صحة بديل لدينا في جهاز الاستشعار البيولوجي في المختبر لتحديد السمية العصبية من ملوثات الهواء، قمنا بقياس استجابة دبقية إلى 20 الفضة النانوية نانومتر (AgNPs). والهدف من هذه المقالة هو شرح طريقة خط خلية دبقية في المختبر يمكن أن تستخدم كعلامة جهاز الاستشعار البيولوجي بديلة لاختبار استجابة الدبقية الفئران لمصادر القدرة النووية وكيف دبيقي تفعيل يؤثر على الخلايا المهاد. يهدف على المدى الطويل تطبيق هذا النموذج التحقق من صحة هو لاختبار آثار الملوثات في العالم الحقيقي على صحة الدماغ والأمراض العصبية التنكسية. ونحن نقدم وصفا مفصلا لفي المختبر 96-جيدا شكل فحص لقياس تفعيل دبقية وبقاء الخلية المهاد بعد التعرض لهيئة التصنيع العسكري roglial سائل الإعلام مكيفة.
تقرر تفعيل دبقية بعد التعرض AgNP باستخدام انزيم TNF-α المناعي المرتبط مقايسة (ELISA). لتحديد تأثير تنشيط الخلايا الدبقية الصغيرة في خلايا المخ تحت المهاد البصري، وإزالة AgNPs من طاف دبقية (وسائل الإعلام مكيفة) باستخدام جهاز الترشيح. يحتفظ الجهاز الترشيح السيتوكينات في حين باستثناء AgNPs على أساس الحجم. لفترة وجيزة، تم جمع طاف من الخلايا الدبقية الصغيرة تعامل مع أو بدون AgNPs، تضاف إلى المرشحات، وطرد في 14000 x ج لمدة 15 دقيقة. كنا بعد ذلك قادرين على تحديد تأثير السيتوكينات يفرز دبقية على بقاء الخلية المهاد. تم تحديد سمية الخلايا بعد التعرض لوسائل الإعلام مكيفة (التي تحتوي على السيتوكينات) عن طريق فحص القائم على ريسازورين كما هو موضح سابقا 5،6. عملية الأيض خلايا نشطة تحد ريسازورين وتنتج إشارة الفلورسنت يتناسب مع عدد من خلايا قابلة للحياة 7.
الإقليم الشمالي "> هناك العديد من المزايا من استخدام هذه التقنية على الآخرين (مثل ثقافة مشتركة، الاجهزة العابر جيدا، أو في التجارب المجراة). نموذجنا يوفر القدرة على تفعيل مباشرة الخلايا الدبقية الصغيرة وتحديد ما إذا كانت العوامل يفرز سامة للخلايا العصبية 8 . البروتوكول الحالي يستخدم خلدت الخلايا الدبقية الصغيرة BV2 حفز مع النانوية قطرها 20 نانومتر، وتخليد خلايا المخ تحت المهاد البصري الفئران (المعين mHypo-A1 / 2) 9 لتحديد استجابة لاحقة. وفي الوقت الذي تم تحسين هذا البروتوكول لهذه الشروط محددة، وأساليب يمكن أن يكون تعديلها لاستخدامها في نماذج أخرى من موت الخلايا التي يسببها دبيقي، أو مع أنواع أخرى من الخلايا بما في ذلك الخلايا الدبقية الصغيرة الابتدائية والخلايا العصبية.Protocol
Representative Results
Discussion
Recent studies support that environmental exposure contributes to obesity and other neurodegenerative diseases 11,12. However, techniques used in previous studies are time consuming and expensive. Economic considerations, physiologically relevant delivery systems, ethical issues with extensive use of in vivo animal models, and difficulty translating findings into meaningful health advisories are a few of the major challenges that have impeded advancements in studying NP-induced neurotoxicity 13</…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work was funded by the US Department of Veterans Affairs BLR&D IK2 BX001686 (to TAB), and grants from the University of Minnesota Healthy Foods, Healthy Lives Institute (to CMD, JPN, and TAB) and the Minnesota Veterans Medical Research & Education Foundation (to TAB). We thank Drs. Philippe Marambaud (Feinstein Institute for Medical Research, Manhasset, NY) and Weihua Zhao (Methodist Hospital, Houston, TX) for providing the BV2 cell line.
Materials
| Cells/Reagents | |||
| Mouse microglial cell line (BV2) | Interlab Cell Line Collection (Genoa, Italy) | ATL03001 | |
| Adult Mouse Hypothalamus Cell Line mHypoA-1/2 | Cellutions Biosystems Inc. | CLU172 | |
| Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium | Invitrogen | 10313-039 | |
| Fetal bovine serum | PAA Labs | A15-751 | |
| Penicillin/Streptomycin/Neomycin | Thermo Fisher Scientific | 15640-055 | |
| Trypsin-EDTA | Thermo Fisher Scientific | 25200056 | |
| Silver nanoparticles (20nm) | Sigma-Aldrich | 730793 | |
PrestoBlue Cell Viability Reagent |
Invitrogen | A13262 | |
| Mouse TNF-α ELISA Max Delux | Biolegend | 430904 | |
| Lipopolysaccharide | Sigma-Aldrich | L4391 | |
| Sodium Citrate | Sigma-Aldrich | S4641 | |
| Equipment | |||
| 96W Optical Bottom Plate, Black Polystyrene, Cell Culture Treated, with lid, Sterile | Thermo Fisher Scientific | 165305 | |
| Amicon Ultra-0.5 Centrifugal Filter Unit with Ultracel-10 membrane | EMD Millipore | UFC501008 | |
| SpectraMax M5 Multi-Mode Microplate | Molecular Devices | M5 | |
| Falcon 50mL Conical Centrifuge Tubes | Corning, Inc | 14-432-22 |
|
| Falcon Cell Strainers 70 μm | Corning, Inc | 08-771-2 | |
| Tabletop centrifuge 5430 | Eppendorf | 22620560 |
Referências
- Block, M. L., Calderon-Garciduenas, L. Air pollution: mechanisms of neuroinflammation and CNS disease. Trends Neurosci. 32, 506-516 (2009).
- Brochu, P., Bouchard, M., Haddad, S. Physiological daily inhalation rates for health risk assessment in overweight/obese children, adults, and elderly. Risk Anal. 34, 567-582 (2014).
- Jerrett, M., et al. Traffic-related air pollution and obesity formation in children: a longitudinal, multilevel analysis. Environ Health. 13, 49 (2014).
- Kraft, A. D., Harry, G. J. Features of microglia and neuroinflammation relevant to environmental exposure and neurotoxicity. Int J Environ Res Public Health. 8, 2980-3018 (2011).
- Duffy, C. M., et al. Role of orexin A signaling in dietary palmitic acid-activated microglial cells. Neurosci Lett. 606, 140-144 (2015).
- Butterick, T. A., et al. Use of a caspase multiplexing assay to determine apoptosis in a hypothalamic cell model. J Vis Exp. , (2014).
- Xiao, J., et al. Monitoring of cell viability and proliferation in hydrogel-encapsulated system by resazurin assay. Appl Biochem Biotechnol. 162, 1996-2007 (2010).
- Blasi, E., Barluzzi, R., Bocchini, V., Mazzolla, R., Bistoni, F. Immortalization of murine microglial cells by a v-raf/v-myc carrying retrovirus. J Neuroimmunol. 27, 229-237 (1990).
- Belsham, D. D., et al. Ciliary neurotrophic factor recruitment of glucagon-like peptide-1 mediates neurogenesis, allowing immortalization of adult murine hypothalamic neurons. FASEB J. 23, 4256-4265 (2009).
- Paramelle, D., et al. A rapid method to estimate the concentration of citrate capped silver nanoparticles from UV-visible light spectra. Analyst. 139, 4855-4861 (2014).
- Wei, Y., et al. Chronic exposure to air pollution particles increases the risk of obesity and metabolic syndrome: findings from a natural experiment in Beijing. FASEB J. , (2016).
- Levesque, S., Surace, M. J., McDonald, J., Block, M. L. Air pollution & the brain: Subchronic diesel exhaust exposure causes neuroinflammation and elevates early markers of neurodegenerative disease. J Neuroinflammation. 8, 105 (2011).
- Block, M. L., et al. The outdoor air pollution and brain health workshop. Neurotoxicology. 33, 972-984 (2012).
- Carson, M. J., Crane, J., Xie, A. X. Modeling CNS microglia: the quest to identify predictive models. Drug Discov Today Dis Models. 5, 19-25 (2008).
- Valdearcos, M., et al. Microglia dictate the impact of saturated fat consumption on hypothalamic inflammation and neuronal function. Cell Rep. 9, 2124-2138 (2014).
- Perry, V. H., Holmes, C. Microglial priming in neurodegenerative disease. Nat Rev Neurol. 10, 217-224 (2014).
- Block, M. L., Hong, J. S. Chronic microglial activation and progressive dopaminergic neurotoxicity. Biochem Soc Trans. 35, 1127-1132 (2007).
- Vincenti, J. E., et al. Defining the Microglia Response during the Time Course of Chronic Neurodegeneration. J Virol. 90, 3003-3017 (2015).
- Grabert, K., et al. Microglial brain region-dependent diversity and selective regional sensitivities to aging. Nat Neurosci. 19, 504-516 (2016).
- Lull, M. E., Block, M. L. Microglial activation and chronic neurodegeneration. Neurotherapeutics. 7, 354-365 (2010).
- Oeckinghaus, A., Hayden, M. S., Ghosh, S. Crosstalk in NF-kappaB signaling pathways. Nat Immunol. 12, 695-708 (2011).
- Gifford, J. C., et al. Thiol-modified gold nanoparticles for the inhibition of Mycobacterium smegmatis. Chem Commun (Camb). 50, 15860-15863 (2014).
- Colella, M., Lobasso, S., Babudri, F., Corcelli, A. Palmitic acid is associated with halorhodopsin as a free fatty acid. Radiolabeling of halorhodopsin with 3H-palmitic acid and chemical analysis of the reaction products of purified halorhodopsin with thiols and NaBH4. Biochim Biophys Acta. 1370, 273-279 (1998).
- Sherry, B., Jue, D. M., Zentella, A., Cerami, A. Characterization of high molecular weight glycosylated forms of murine tumor necrosis factor. Biochem Biophys Res Commun. 173, 1072-1078 (1990).
- . PubChem Compound Database Available from: https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/compound/104755 (2004)
- Koenigsknecht-Talboo, J., Landreth, G. E. Microglial phagocytosis induced by fibrillar beta-amyloid and IgGs are differentially regulated by proinflammatory cytokines. J Neurosci. 25, 8240-8249 (2005).
- McCarthy, R. C., et al. Characterization of a novel adult murine immortalized microglial cell line and its activation by amyloid-beta. J Neuroinflammation. 13, (2016).
- Schauer, J. J., et al. Source apportionment of airborne particulate matter using organic compounds as tracers. Atmos Environ. 30, 3837-3855 (1996).
- Kleeman, M. J., et al. Source apportionment of fine (PM1.8) and ultrafine (PM0.1) airborne particulate matter during a severe winter pollution episode. Environ Sci Technol. 43, 272-279 (2009).
- Borm, P. J., et al. The potential risks of nanomaterials: a review carried out for ECETOC. Part Fibre Toxicol. 3, (2006).
