Microglia בתור biosensor סרוגייט לקביעת Nanoparticle neurotoxicity
Summary
Microglia (immune cells of the brain), are used as a surrogate biosensor to determine how nanoparticles influence neurotoxicity. We describe a series of experiments designed to assay microglial response to nanoparticles and exposure of hypothalamic neurons to supernatant from activated microglia to determine neurotoxicity.
Abstract
Nanoparticles found in air pollutants can alter neurotransmitter profiles, increase neuroinflammation, and alter brain function. Therefore, the assay described here will aid in elucidating the role of microglia in neuroinflammation and neurodegenerative diseases. The use of microglia, resident immune cells of the brain, as a surrogate biosensor provides novel insight into how inflammatory responses mediate neuronal insults. Here, we utilize an immortalized murine microglial cell line, designated BV2, and describe a method for nanoparticle exposure using silver nanoparticles (AgNPs) as a standard. We describe how to expose microglia to nanoparticles, how to remove nanoparticles from supernatant, and how to use supernatant from activated microglia to determine toxicity, using hypothalamic cell survival as a measure. Following AgNP exposure, BV2 microglial activation was validated using a tumor necrosis factor alpha (TNF-α) enzyme linked immunosorbent assay (ELISA). The supernatant was filtered to remove the AgNP and to allow cytokines and other secreted factors to remain in the conditioned media. Hypothalamic cells were then exposed to supernatant from AgNP activated microglia and survival of neurons was determined using a resazurin-based fluorescent assay. This technique is useful for utilizing microglia as a surrogate biomarker of neuroinflammation and determining the effect of neuroinflammation on other cell types.
Introduction
זיהומים סביבתיים, במיוחד אלה של הטווח ננו-חלקיקים (NP) (1 – 20 בקוטר ננומטר), נקשרו להשמנה ומחלות ניווניות אחרות בשל היכולת לחצות את מחסום דם מוח 1-3. חשיפה גבוהה לזיהום עלולה לגרום לדלקת במערכת העצבים המרכזית כולל ההיפותלמוס 1. מנגנון אפשרי אחד שבו זה מתרחש יכול להיות באמצעות הפעלת המושרה ננו-חלקיקים של microglia (תאי מערכת החיסון במוח) 4. מחקרים קודמים השתמשו במודלים vivo כדי לחקור את ההשפעות של צירופים על בריאות המוח אשר זמן רב, יקר, ובאופן ישיר לא לענות על השאלה של איך צירופים להשפיע microglia. Microglia לשחק תפקיד רב במערכת העצבים המרכזית, כולל תחזוקה של microenvironment המוח ובתקשורת עם סובבים נוירונים באמצעות שחרור גורמים מופרשים וציטוקינים. בהתאם לגירויים, microglia יכול להיות מופעל כדי יחסי ציבור M1o-דלקתי או מדינה אנטי דלקתית M2. לדוגמה, M1 מופעל microglia לשחרר ציטוקינים פרו-דלקתיים כגון אלפא tumor necrosis factor (TNF-α), ואילו M2 מופעל ציטוקינים אנטי דלקתיות שחרור microglia כולל interleukin-4 (IL-4). כדי לאמת פונדקאית שלנו biosensor במבחנה לקביעת רעילות עצבית של מזהמי אוויר, מדדנו תגובה microglial עד 20 חלקיקי כסף ננומטר (AgNPs). מטרת מאמר זה היא לתאר כיצד קו תאים במבחנה microglial יכול לשמש כסמן biosensor פונדקאית לבדיקת תגובה microglial בעכברים כדי צירופים ואיך microglial ההפעלה משפיע על תאים ההיפותלמוס. לטווח הארוך נועד יישום של מודל תוקף זה הוא לבחון השפעות של מזהמים לגבי עולם האמיתי בריאות המוח ומחלות ניווניות. אנו מספקים תיאור מפורט של assay בפורמט במבחנה 96-היטב למדידת ההפעלה microglial והישרדות התא ההיפותלמוס בעקבות חשיפת מיקרופון roglial תקשורת מותנית.
הפעלת microglial נקבעה בעקבות חשיפת AgNP באמצעות אנזים TNF-α מקושר immunosorbent assay (ELISA). כדי לקבוע את ההשפעה של microglia מופעל על תאים ההיפותלמוס, את AgNPs הוצא supernatant microglial (מדיה מותנית) באמצעות מכשיר סינון. מכשיר הסינון שומר ציטוקינים ובמקביל לא תכלול AgNPs על בסיס הגודל. בקצרה, supernatant מן microglia מטופלים עם או בלי AgNPs נאסף, להוסיף את המסננים, centrifuged ב 14,000 XG במשך 15 דקות. היינו אז מסוגל לקבוע את ההשפעה של ציטוקינים המופרשים microglial על כדאיות התא ההיפותלמוס. רעילות לתא בעקבות חשיפה בתקשורת מותנית (ציטוקינים המכיל) נקבעו באמצעות assay מבוסס resazurin כפי שתוארו לעיל 5,6. מבחינה מטבולית תאים פעילים להפחית resazurin ולהפיק אות ניאון ביחס ישר למספר התאים קיימא 7.
NT "> ישנם מספר יתרונות של שימוש בטכניקה זו על פני אחרים (כגון שיתוף תרבות, setups היטב טרנס, או בניסויים vivo). המודל שלנו מספק את היכולת להפעיל ישירות המיקרוגליה לקבוע אם גורמים המופרשים רעילים לנוירונים 8 . הפרוטוקול הנוכחי משתמש microglia BV2 הנציח מגורה עם 20 חלקיקים ננומטר בקוטר, והנציח תאים ההיפותלמוס בעכברים (מיועד mHypo-A1 / 2) 9 לקביעה בתגובה שלאחר מכן. בעוד פרוטוקול זה כבר מותאם תנאים ספציפיים האלה, השיטות יכולות להיות שיניתי לשמש מודלים אחרים של מוות תאי מושרה microglial, או עם סוגי תאים אחרים, כולל המיקרוגליה הנוירונים עיקריים.Protocol
Representative Results
Discussion
Recent studies support that environmental exposure contributes to obesity and other neurodegenerative diseases 11,12. However, techniques used in previous studies are time consuming and expensive. Economic considerations, physiologically relevant delivery systems, ethical issues with extensive use of in vivo animal models, and difficulty translating findings into meaningful health advisories are a few of the major challenges that have impeded advancements in studying NP-induced neurotoxicity 13</…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work was funded by the US Department of Veterans Affairs BLR&D IK2 BX001686 (to TAB), and grants from the University of Minnesota Healthy Foods, Healthy Lives Institute (to CMD, JPN, and TAB) and the Minnesota Veterans Medical Research & Education Foundation (to TAB). We thank Drs. Philippe Marambaud (Feinstein Institute for Medical Research, Manhasset, NY) and Weihua Zhao (Methodist Hospital, Houston, TX) for providing the BV2 cell line.
Materials
| Cells/Reagents | |||
| Mouse microglial cell line (BV2) | Interlab Cell Line Collection (Genoa, Italy) | ATL03001 | |
| Adult Mouse Hypothalamus Cell Line mHypoA-1/2 | Cellutions Biosystems Inc. | CLU172 | |
| Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium | Invitrogen | 10313-039 | |
| Fetal bovine serum | PAA Labs | A15-751 | |
| Penicillin/Streptomycin/Neomycin | Thermo Fisher Scientific | 15640-055 | |
| Trypsin-EDTA | Thermo Fisher Scientific | 25200056 | |
| Silver nanoparticles (20nm) | Sigma-Aldrich | 730793 | |
PrestoBlue Cell Viability Reagent |
Invitrogen | A13262 | |
| Mouse TNF-α ELISA Max Delux | Biolegend | 430904 | |
| Lipopolysaccharide | Sigma-Aldrich | L4391 | |
| Sodium Citrate | Sigma-Aldrich | S4641 | |
| Equipment | |||
| 96W Optical Bottom Plate, Black Polystyrene, Cell Culture Treated, with lid, Sterile | Thermo Fisher Scientific | 165305 | |
| Amicon Ultra-0.5 Centrifugal Filter Unit with Ultracel-10 membrane | EMD Millipore | UFC501008 | |
| SpectraMax M5 Multi-Mode Microplate | Molecular Devices | M5 | |
| Falcon 50mL Conical Centrifuge Tubes | Corning, Inc | 14-432-22 |
|
| Falcon Cell Strainers 70 μm | Corning, Inc | 08-771-2 | |
| Tabletop centrifuge 5430 | Eppendorf | 22620560 |
Referências
- Block, M. L., Calderon-Garciduenas, L. Air pollution: mechanisms of neuroinflammation and CNS disease. Trends Neurosci. 32, 506-516 (2009).
- Brochu, P., Bouchard, M., Haddad, S. Physiological daily inhalation rates for health risk assessment in overweight/obese children, adults, and elderly. Risk Anal. 34, 567-582 (2014).
- Jerrett, M., et al. Traffic-related air pollution and obesity formation in children: a longitudinal, multilevel analysis. Environ Health. 13, 49 (2014).
- Kraft, A. D., Harry, G. J. Features of microglia and neuroinflammation relevant to environmental exposure and neurotoxicity. Int J Environ Res Public Health. 8, 2980-3018 (2011).
- Duffy, C. M., et al. Role of orexin A signaling in dietary palmitic acid-activated microglial cells. Neurosci Lett. 606, 140-144 (2015).
- Butterick, T. A., et al. Use of a caspase multiplexing assay to determine apoptosis in a hypothalamic cell model. J Vis Exp. , (2014).
- Xiao, J., et al. Monitoring of cell viability and proliferation in hydrogel-encapsulated system by resazurin assay. Appl Biochem Biotechnol. 162, 1996-2007 (2010).
- Blasi, E., Barluzzi, R., Bocchini, V., Mazzolla, R., Bistoni, F. Immortalization of murine microglial cells by a v-raf/v-myc carrying retrovirus. J Neuroimmunol. 27, 229-237 (1990).
- Belsham, D. D., et al. Ciliary neurotrophic factor recruitment of glucagon-like peptide-1 mediates neurogenesis, allowing immortalization of adult murine hypothalamic neurons. FASEB J. 23, 4256-4265 (2009).
- Paramelle, D., et al. A rapid method to estimate the concentration of citrate capped silver nanoparticles from UV-visible light spectra. Analyst. 139, 4855-4861 (2014).
- Wei, Y., et al. Chronic exposure to air pollution particles increases the risk of obesity and metabolic syndrome: findings from a natural experiment in Beijing. FASEB J. , (2016).
- Levesque, S., Surace, M. J., McDonald, J., Block, M. L. Air pollution & the brain: Subchronic diesel exhaust exposure causes neuroinflammation and elevates early markers of neurodegenerative disease. J Neuroinflammation. 8, 105 (2011).
- Block, M. L., et al. The outdoor air pollution and brain health workshop. Neurotoxicology. 33, 972-984 (2012).
- Carson, M. J., Crane, J., Xie, A. X. Modeling CNS microglia: the quest to identify predictive models. Drug Discov Today Dis Models. 5, 19-25 (2008).
- Valdearcos, M., et al. Microglia dictate the impact of saturated fat consumption on hypothalamic inflammation and neuronal function. Cell Rep. 9, 2124-2138 (2014).
- Perry, V. H., Holmes, C. Microglial priming in neurodegenerative disease. Nat Rev Neurol. 10, 217-224 (2014).
- Block, M. L., Hong, J. S. Chronic microglial activation and progressive dopaminergic neurotoxicity. Biochem Soc Trans. 35, 1127-1132 (2007).
- Vincenti, J. E., et al. Defining the Microglia Response during the Time Course of Chronic Neurodegeneration. J Virol. 90, 3003-3017 (2015).
- Grabert, K., et al. Microglial brain region-dependent diversity and selective regional sensitivities to aging. Nat Neurosci. 19, 504-516 (2016).
- Lull, M. E., Block, M. L. Microglial activation and chronic neurodegeneration. Neurotherapeutics. 7, 354-365 (2010).
- Oeckinghaus, A., Hayden, M. S., Ghosh, S. Crosstalk in NF-kappaB signaling pathways. Nat Immunol. 12, 695-708 (2011).
- Gifford, J. C., et al. Thiol-modified gold nanoparticles for the inhibition of Mycobacterium smegmatis. Chem Commun (Camb). 50, 15860-15863 (2014).
- Colella, M., Lobasso, S., Babudri, F., Corcelli, A. Palmitic acid is associated with halorhodopsin as a free fatty acid. Radiolabeling of halorhodopsin with 3H-palmitic acid and chemical analysis of the reaction products of purified halorhodopsin with thiols and NaBH4. Biochim Biophys Acta. 1370, 273-279 (1998).
- Sherry, B., Jue, D. M., Zentella, A., Cerami, A. Characterization of high molecular weight glycosylated forms of murine tumor necrosis factor. Biochem Biophys Res Commun. 173, 1072-1078 (1990).
- . PubChem Compound Database Available from: https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/compound/104755 (2004)
- Koenigsknecht-Talboo, J., Landreth, G. E. Microglial phagocytosis induced by fibrillar beta-amyloid and IgGs are differentially regulated by proinflammatory cytokines. J Neurosci. 25, 8240-8249 (2005).
- McCarthy, R. C., et al. Characterization of a novel adult murine immortalized microglial cell line and its activation by amyloid-beta. J Neuroinflammation. 13, (2016).
- Schauer, J. J., et al. Source apportionment of airborne particulate matter using organic compounds as tracers. Atmos Environ. 30, 3837-3855 (1996).
- Kleeman, M. J., et al. Source apportionment of fine (PM1.8) and ultrafine (PM0.1) airborne particulate matter during a severe winter pollution episode. Environ Sci Technol. 43, 272-279 (2009).
- Borm, P. J., et al. The potential risks of nanomaterials: a review carried out for ECETOC. Part Fibre Toxicol. 3, (2006).
