ナノ粒子神経毒性を決定するために、代理バイオセンサーとしてミクログリア
Summary
Microglia (immune cells of the brain), are used as a surrogate biosensor to determine how nanoparticles influence neurotoxicity. We describe a series of experiments designed to assay microglial response to nanoparticles and exposure of hypothalamic neurons to supernatant from activated microglia to determine neurotoxicity.
Abstract
Nanoparticles found in air pollutants can alter neurotransmitter profiles, increase neuroinflammation, and alter brain function. Therefore, the assay described here will aid in elucidating the role of microglia in neuroinflammation and neurodegenerative diseases. The use of microglia, resident immune cells of the brain, as a surrogate biosensor provides novel insight into how inflammatory responses mediate neuronal insults. Here, we utilize an immortalized murine microglial cell line, designated BV2, and describe a method for nanoparticle exposure using silver nanoparticles (AgNPs) as a standard. We describe how to expose microglia to nanoparticles, how to remove nanoparticles from supernatant, and how to use supernatant from activated microglia to determine toxicity, using hypothalamic cell survival as a measure. Following AgNP exposure, BV2 microglial activation was validated using a tumor necrosis factor alpha (TNF-α) enzyme linked immunosorbent assay (ELISA). The supernatant was filtered to remove the AgNP and to allow cytokines and other secreted factors to remain in the conditioned media. Hypothalamic cells were then exposed to supernatant from AgNP activated microglia and survival of neurons was determined using a resazurin-based fluorescent assay. This technique is useful for utilizing microglia as a surrogate biomarker of neuroinflammation and determining the effect of neuroinflammation on other cell types.
Introduction
環境汚染は、具体的には、これらのナノ粒子（NP）の範囲の（1から20 nmの直径）、肥満および血液脳関門1-3を通過する能力に起因する他の神経変性疾患にリンクされています。汚染への高められた曝露は視床下部1を含む中枢神経系の炎症を誘発することができます。これが発生した一つの潜在的メカニズムは、ミクログリア（脳の免疫細胞）4のナノ粒子誘導活性化を介して可能性があります。以前の研究は、時間がかかり、高価であり、脳の健康上のNPの効果を研究するためにin vivoモデルで使用されており、直接NPはミクログリアにどのように影響するかの質問に答えていません。ミクログリアは、脳の微小環境の維持と分泌因子およびサイトカインの放出を介して、周囲のニューロンとの通信などの中枢神経系における多面的な役割を、果たしています。刺激に応じて、ミクログリアは、M1の広報に活性化することができますO-炎症またはM2抗炎症状態。 M2は、インターロイキン-4（IL-4）を含むミクログリア放出抗炎症性サイトカインを活性化しながら、例えば、M1は、ミクログリアは、腫瘍壊死因子α（TNF-α）などの炎症性サイトカインを放出する活性化しました。大気汚染物質の神経毒性を決定するためのインビトロのバイオセンサーにおける当社の代理を検証するために、我々は、20nmの銀ナノ粒子（AgNPs）へのミクログリアの応答を測定しました。この記事の目的は、in vitroミクログリア細胞株は、マウスミクログリアのNPに対応し、どのようにミクログリアの活性化は、視床下部の細胞に影響を与えるをテストするための代理バイオセンサーのマーカーとして使用する方法を説明することです。この検証モデルの長期的な意図されたアプリケーションは、脳の健康と神経変性疾患に実世界の汚染物質の影響をテストすることです。我々は、マイクの暴露後のミクログリア活性化および視床下部の細胞の生存を測定するためのインビトロの 96ウェルフォーマットアッセイの詳細な説明を提供します馴化培地をroglial。
ミクログリア活性化は、免疫吸着アッセイ（ELISA）結合されたTNF-αの酵素を用いAgNP暴露後測定しました。視床下部細胞上の活性化ミクログリアの効果を決定するために、AgNPsは濾過装置を用いて、ミクログリア上清（馴化培地）から削除されました。サイズに基づいてAgNPsを排除しながら濾過装置は、サイトカインを保持します。簡潔には、AgNPsの有無にかかわらず処理されたミクログリアからの上清を、収集し、フィルタに添加し、そして15分間、14,000×gで遠心分離しました。我々は、次に、視床下部の細胞生存率に対するミクログリア分泌されるサイトカインの影響を決定することができました。以前に5,6に記載されているように馴化培地（サイトカインを含む）への曝露後の細胞毒性はレサズリンベースのアッセイによって測定しました。代謝活性細胞はレザズリンを減少させ、生存細胞7の数に比例した蛍光シグナルを生成します。
NT ">（例えば、またはin vivo実験で共培養、トランスウェルのセットアップのような）他のものよりも、この技術を使用することのいくつかの利点がある。我々のモデルは、直接ミクログリアを活性化し、分泌された因子は、ニューロン8に毒性であるかどうかを決定する能力を提供します現在のプロトコルの使用は、BV2ミクログリアは、このプロトコルは、これらの特定の状況のために最適化されているが、方法があることができる。それに続く応答の決意9（mHypo-A1 / 2と命名）20 nmの直径のナノ粒子で刺激し、そしてマウスの視床下部の細胞を不死化し、不死化ミクログリア誘導細胞死の他のモデルにおいて、または一次ミクログリアおよびニューロンを含む他の細胞型で使用される改変されました。Protocol
Representative Results
Discussion
Recent studies support that environmental exposure contributes to obesity and other neurodegenerative diseases 11,12. However, techniques used in previous studies are time consuming and expensive. Economic considerations, physiologically relevant delivery systems, ethical issues with extensive use of in vivo animal models, and difficulty translating findings into meaningful health advisories are a few of the major challenges that have impeded advancements in studying NP-induced neurotoxicity 13</…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work was funded by the US Department of Veterans Affairs BLR&D IK2 BX001686 (to TAB), and grants from the University of Minnesota Healthy Foods, Healthy Lives Institute (to CMD, JPN, and TAB) and the Minnesota Veterans Medical Research & Education Foundation (to TAB). We thank Drs. Philippe Marambaud (Feinstein Institute for Medical Research, Manhasset, NY) and Weihua Zhao (Methodist Hospital, Houston, TX) for providing the BV2 cell line.
Materials
| Cells/Reagents | |||
| Mouse microglial cell line (BV2) | Interlab Cell Line Collection (Genoa, Italy) | ATL03001 | |
| Adult Mouse Hypothalamus Cell Line mHypoA-1/2 | Cellutions Biosystems Inc. | CLU172 | |
| Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium | Invitrogen | 10313-039 | |
| Fetal bovine serum | PAA Labs | A15-751 | |
| Penicillin/Streptomycin/Neomycin | Thermo Fisher Scientific | 15640-055 | |
| Trypsin-EDTA | Thermo Fisher Scientific | 25200056 | |
| Silver nanoparticles (20nm) | Sigma-Aldrich | 730793 | |
PrestoBlue Cell Viability Reagent |
Invitrogen | A13262 | |
| Mouse TNF-α ELISA Max Delux | Biolegend | 430904 | |
| Lipopolysaccharide | Sigma-Aldrich | L4391 | |
| Sodium Citrate | Sigma-Aldrich | S4641 | |
| Equipment | |||
| 96W Optical Bottom Plate, Black Polystyrene, Cell Culture Treated, with lid, Sterile | Thermo Fisher Scientific | 165305 | |
| Amicon Ultra-0.5 Centrifugal Filter Unit with Ultracel-10 membrane | EMD Millipore | UFC501008 | |
| SpectraMax M5 Multi-Mode Microplate | Molecular Devices | M5 | |
| Falcon 50mL Conical Centrifuge Tubes | Corning, Inc | 14-432-22 |
|
| Falcon Cell Strainers 70 μm | Corning, Inc | 08-771-2 | |
| Tabletop centrifuge 5430 | Eppendorf | 22620560 |
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