나노 입자 신경 독성을 결정하는 대리 바이오 센서로 미세 아교 세포
Summary
Microglia (immune cells of the brain), are used as a surrogate biosensor to determine how nanoparticles influence neurotoxicity. We describe a series of experiments designed to assay microglial response to nanoparticles and exposure of hypothalamic neurons to supernatant from activated microglia to determine neurotoxicity.
Abstract
Nanoparticles found in air pollutants can alter neurotransmitter profiles, increase neuroinflammation, and alter brain function. Therefore, the assay described here will aid in elucidating the role of microglia in neuroinflammation and neurodegenerative diseases. The use of microglia, resident immune cells of the brain, as a surrogate biosensor provides novel insight into how inflammatory responses mediate neuronal insults. Here, we utilize an immortalized murine microglial cell line, designated BV2, and describe a method for nanoparticle exposure using silver nanoparticles (AgNPs) as a standard. We describe how to expose microglia to nanoparticles, how to remove nanoparticles from supernatant, and how to use supernatant from activated microglia to determine toxicity, using hypothalamic cell survival as a measure. Following AgNP exposure, BV2 microglial activation was validated using a tumor necrosis factor alpha (TNF-α) enzyme linked immunosorbent assay (ELISA). The supernatant was filtered to remove the AgNP and to allow cytokines and other secreted factors to remain in the conditioned media. Hypothalamic cells were then exposed to supernatant from AgNP activated microglia and survival of neurons was determined using a resazurin-based fluorescent assay. This technique is useful for utilizing microglia as a surrogate biomarker of neuroinflammation and determining the effect of neuroinflammation on other cell types.
Introduction
환경 오염은 특히 나노 입자 (NP)의 범위들 (1-20 nm의 직경), 비만 및 혈액 뇌 장벽 1-3을 통과 할 수있는 능력으로 인해 다른 신경 퇴행성 질환과 관련이있다. 오염에 대한 높은 노출은 시상 하나를 포함하는 중추 신경계의 염증을 유발할 수있다. 이 미세 아교 세포의 나노 입자 유도 활성화 (뇌 면역 세포) (4)를 통해 할 수 발생하는 하나의 잠재적 인 메커니즘. 선행 연구는 시간 소모, 고가 뇌의 건강에 NP에의 영향을 연구하기 위해 생체 내 모델에서 사용한 직접 NPS에서 미세 아교 세포에 영향을 미치는 방법에 대한 질문에 응답하지 않는다. 미세 아교 세포는 뇌의 미세 환경의 유지를 포함하여 분비 인자 및 사이토 카인의 방출을 통해 신경 주변 통신, 중추 신경계 다각적 역할을한다. 자극에 따라, 미세 아교 세포는 M1 홍보에 활성화 될 수있다오 염증 또는 M2 항 염증 상태. M2는 인터루킨 -4 (IL-4)를 포함하여 미세 아교 세포 분리 항 염증성 사이토 카인으로 활성화 예를 들어, M1은, 미세 아교 세포는 종양 괴사 인자 알파 (TNF-α)와 같은 염증성 사이토 카인 방출 활성화. 대기 오염 물질의 신경 독성을 결정하기위한 시험 관내 바이오 센서 우리의 대리를 확인하기 위해, 우리는 20 nm의 나노 입자 (AGNPS)에 소교 반응을 측정했다. 이 문서의 목적은 시험 관내 소교 세포주가 NP에에 쥐 소교 반응을 테스트하는 방법과 미세 아교 활성화가 시상 하부 세포에 영향을 미치는위한 대리 바이오 마커로 사용하는 방법을 설명하는 것입니다. 장기는이 검증 된 모델의 응용 프로그램이 뇌 건강과 신경 퇴행성 질환에 대한 실제 오염 물질의 효과를 테스트하는 것입니다 예정. 우리는 마이크의 노출 후 미세 아교 활성화 및 시상 세포 생존율을 측정하기위한 시험 관내 96 웰 형식 분석의 상세한 설명을 제공한다 에어컨 미디어를 roglial.
소교 활성화는 (ELISA)을 면역 측정법 링크 된 TNF-α의 효소를 사용하여 노광 AgNP 따라 결정 하였다. 시상 세포에서 활성화 된 미세 아교 세포의 효과를 결정하기 위해 AGNPS는 여과 장치를 이용하여 상층 액 소교 (조정 배지)에서 제거 하였다. 크기에 따라 AGNPS을 배제하면서 여과 장치 사이토킨을 유지한다. 간단히, AGNPS 또는 처리없이 미세 아교 세포의 상등액을 수거 필터에 첨가하고, 15 분 동안 14,000 × g으로 원심 분리 하였다. 그런 다음 시상 세포 생존에 소교 분비 된 사이토 카인의 영향을 확인할 수 있었다. 이전 5,6 설명 된대로 에어컨 미디어 (포함하는 사이토 카인)에 노출 된 후 세포 독성은 레사 주린 기반 분석을 통해 측정 하였다. 대사 적 활성 세포 레사 주린을 줄이고 생세포 (7)의 수에 비례하여 형광 신호를 생성한다.
NT "> (예, 또는 생체 내 실험에서 공동 배양 트랜스 웰 설정 등) 등을 통해이 기술을 사용하여 여러 가지 이점이있다. 우리의 모델은 직접적으로 미세 아교 세포 활성화 및 분비 인자 뉴런 8 독성 여부를 결정하는 능력을 제공한다 . 현재의 프로토콜은 불후의 BV2의 미세 아교 세포는 쥐의 시상 하부 세포를이 프로토콜은 이러한 특정 조건에 최적화되었지만 (지정하는 mHypo-A1 / 2) 이후의 반응의 결정에 대한 9., 방법이 될 수 있습니다 20 나노 미터 직경의 나노 입자로 자극하고, 불멸 사용합니다 변경된은 소교에 의한 세포 사멸의 다른 모델에 사용, 또는 기본 미세 아교 세포와 신경 세포를 포함한 다른 세포 유형으로합니다.Protocol
Representative Results
Discussion
Recent studies support that environmental exposure contributes to obesity and other neurodegenerative diseases 11,12. However, techniques used in previous studies are time consuming and expensive. Economic considerations, physiologically relevant delivery systems, ethical issues with extensive use of in vivo animal models, and difficulty translating findings into meaningful health advisories are a few of the major challenges that have impeded advancements in studying NP-induced neurotoxicity 13</…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work was funded by the US Department of Veterans Affairs BLR&D IK2 BX001686 (to TAB), and grants from the University of Minnesota Healthy Foods, Healthy Lives Institute (to CMD, JPN, and TAB) and the Minnesota Veterans Medical Research & Education Foundation (to TAB). We thank Drs. Philippe Marambaud (Feinstein Institute for Medical Research, Manhasset, NY) and Weihua Zhao (Methodist Hospital, Houston, TX) for providing the BV2 cell line.
Materials
| Cells/Reagents | |||
| Mouse microglial cell line (BV2) | Interlab Cell Line Collection (Genoa, Italy) | ATL03001 | |
| Adult Mouse Hypothalamus Cell Line mHypoA-1/2 | Cellutions Biosystems Inc. | CLU172 | |
| Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium | Invitrogen | 10313-039 | |
| Fetal bovine serum | PAA Labs | A15-751 | |
| Penicillin/Streptomycin/Neomycin | Thermo Fisher Scientific | 15640-055 | |
| Trypsin-EDTA | Thermo Fisher Scientific | 25200056 | |
| Silver nanoparticles (20nm) | Sigma-Aldrich | 730793 | |
PrestoBlue Cell Viability Reagent |
Invitrogen | A13262 | |
| Mouse TNF-α ELISA Max Delux | Biolegend | 430904 | |
| Lipopolysaccharide | Sigma-Aldrich | L4391 | |
| Sodium Citrate | Sigma-Aldrich | S4641 | |
| Equipment | |||
| 96W Optical Bottom Plate, Black Polystyrene, Cell Culture Treated, with lid, Sterile | Thermo Fisher Scientific | 165305 | |
| Amicon Ultra-0.5 Centrifugal Filter Unit with Ultracel-10 membrane | EMD Millipore | UFC501008 | |
| SpectraMax M5 Multi-Mode Microplate | Molecular Devices | M5 | |
| Falcon 50mL Conical Centrifuge Tubes | Corning, Inc | 14-432-22 |
|
| Falcon Cell Strainers 70 μm | Corning, Inc | 08-771-2 | |
| Tabletop centrifuge 5430 | Eppendorf | 22620560 |
Referências
- Block, M. L., Calderon-Garciduenas, L. Air pollution: mechanisms of neuroinflammation and CNS disease. Trends Neurosci. 32, 506-516 (2009).
- Brochu, P., Bouchard, M., Haddad, S. Physiological daily inhalation rates for health risk assessment in overweight/obese children, adults, and elderly. Risk Anal. 34, 567-582 (2014).
- Jerrett, M., et al. Traffic-related air pollution and obesity formation in children: a longitudinal, multilevel analysis. Environ Health. 13, 49 (2014).
- Kraft, A. D., Harry, G. J. Features of microglia and neuroinflammation relevant to environmental exposure and neurotoxicity. Int J Environ Res Public Health. 8, 2980-3018 (2011).
- Duffy, C. M., et al. Role of orexin A signaling in dietary palmitic acid-activated microglial cells. Neurosci Lett. 606, 140-144 (2015).
- Butterick, T. A., et al. Use of a caspase multiplexing assay to determine apoptosis in a hypothalamic cell model. J Vis Exp. , (2014).
- Xiao, J., et al. Monitoring of cell viability and proliferation in hydrogel-encapsulated system by resazurin assay. Appl Biochem Biotechnol. 162, 1996-2007 (2010).
- Blasi, E., Barluzzi, R., Bocchini, V., Mazzolla, R., Bistoni, F. Immortalization of murine microglial cells by a v-raf/v-myc carrying retrovirus. J Neuroimmunol. 27, 229-237 (1990).
- Belsham, D. D., et al. Ciliary neurotrophic factor recruitment of glucagon-like peptide-1 mediates neurogenesis, allowing immortalization of adult murine hypothalamic neurons. FASEB J. 23, 4256-4265 (2009).
- Paramelle, D., et al. A rapid method to estimate the concentration of citrate capped silver nanoparticles from UV-visible light spectra. Analyst. 139, 4855-4861 (2014).
- Wei, Y., et al. Chronic exposure to air pollution particles increases the risk of obesity and metabolic syndrome: findings from a natural experiment in Beijing. FASEB J. , (2016).
- Levesque, S., Surace, M. J., McDonald, J., Block, M. L. Air pollution & the brain: Subchronic diesel exhaust exposure causes neuroinflammation and elevates early markers of neurodegenerative disease. J Neuroinflammation. 8, 105 (2011).
- Block, M. L., et al. The outdoor air pollution and brain health workshop. Neurotoxicology. 33, 972-984 (2012).
- Carson, M. J., Crane, J., Xie, A. X. Modeling CNS microglia: the quest to identify predictive models. Drug Discov Today Dis Models. 5, 19-25 (2008).
- Valdearcos, M., et al. Microglia dictate the impact of saturated fat consumption on hypothalamic inflammation and neuronal function. Cell Rep. 9, 2124-2138 (2014).
- Perry, V. H., Holmes, C. Microglial priming in neurodegenerative disease. Nat Rev Neurol. 10, 217-224 (2014).
- Block, M. L., Hong, J. S. Chronic microglial activation and progressive dopaminergic neurotoxicity. Biochem Soc Trans. 35, 1127-1132 (2007).
- Vincenti, J. E., et al. Defining the Microglia Response during the Time Course of Chronic Neurodegeneration. J Virol. 90, 3003-3017 (2015).
- Grabert, K., et al. Microglial brain region-dependent diversity and selective regional sensitivities to aging. Nat Neurosci. 19, 504-516 (2016).
- Lull, M. E., Block, M. L. Microglial activation and chronic neurodegeneration. Neurotherapeutics. 7, 354-365 (2010).
- Oeckinghaus, A., Hayden, M. S., Ghosh, S. Crosstalk in NF-kappaB signaling pathways. Nat Immunol. 12, 695-708 (2011).
- Gifford, J. C., et al. Thiol-modified gold nanoparticles for the inhibition of Mycobacterium smegmatis. Chem Commun (Camb). 50, 15860-15863 (2014).
- Colella, M., Lobasso, S., Babudri, F., Corcelli, A. Palmitic acid is associated with halorhodopsin as a free fatty acid. Radiolabeling of halorhodopsin with 3H-palmitic acid and chemical analysis of the reaction products of purified halorhodopsin with thiols and NaBH4. Biochim Biophys Acta. 1370, 273-279 (1998).
- Sherry, B., Jue, D. M., Zentella, A., Cerami, A. Characterization of high molecular weight glycosylated forms of murine tumor necrosis factor. Biochem Biophys Res Commun. 173, 1072-1078 (1990).
- . PubChem Compound Database Available from: https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/compound/104755 (2004)
- Koenigsknecht-Talboo, J., Landreth, G. E. Microglial phagocytosis induced by fibrillar beta-amyloid and IgGs are differentially regulated by proinflammatory cytokines. J Neurosci. 25, 8240-8249 (2005).
- McCarthy, R. C., et al. Characterization of a novel adult murine immortalized microglial cell line and its activation by amyloid-beta. J Neuroinflammation. 13, (2016).
- Schauer, J. J., et al. Source apportionment of airborne particulate matter using organic compounds as tracers. Atmos Environ. 30, 3837-3855 (1996).
- Kleeman, M. J., et al. Source apportionment of fine (PM1.8) and ultrafine (PM0.1) airborne particulate matter during a severe winter pollution episode. Environ Sci Technol. 43, 272-279 (2009).
- Borm, P. J., et al. The potential risks of nanomaterials: a review carried out for ECETOC. Part Fibre Toxicol. 3, (2006).
