Aqui, apresentamos metodologia para gerar e administrar compostos de microesferas de poli(ácido lático-co-glicólico) (PLGA) carregadas de interesse para ilhotas de camundongos intactas em cultura com subsequente análise de imunofluorescência da proliferação de células β. Este método é adequado para determinar a eficácia de mitógenos candidatos a β células.
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Artigo de método
Administração sustentada dos mitógenos de células β para intactas mouse Ilhotas
Neste artigo
Resumo
Resumo
O desenvolvimento de biomateriais aumentou significativamente o potencial para a entrega de drogas alvo para uma variedade de tipos de células e de tecidos, incluindo as células beta pancreáticas. Além disso, biomateriais partículas, hidrogéis, e andaimes também oferecem uma oportunidade única para administrar sustentada, a entrega de drogas controlável a p-células em cultura e em modelos de tecidos transplantados. Estas tecnologias permitem o estudo de fatores de proliferação de células β candidato usando ilhotas intactas e um sistema de translação relevante. Além disso, determinar a eficácia ea viabilidade de fatores candidatos para estimular a proliferação de células β em um sistema de cultura é fundamental antes de avançar para modelos in vivo. Aqui, nós descrevemos um método para co-cultura ilhotas intactas rato com o composto biodegradável de interesse (COI) poli -loaded (ácido láctico-co-glicólico) (PLGA) com a finalidade de avaliar os efeitos das sustentada in situ release of factores mitogénicos sobre a proliferação de células β. Esta técnica descreve em detalhe como gerar microesferas de PLGA contendo uma carga desejado, utilizando reagentes disponíveis comercialmente. Embora a técnica descrita utiliza factor de crescimento humano recombinante conjuntivo tecido (rhCTGF) como um exemplo, pode ser prontamente utilizada uma ampla variedade de COI. Além disso, este método utiliza placas de 96 poços para minimizar a quantidade de reagentes necessários para avaliar a proliferação de células β. Este protocolo pode ser facilmente adaptado para utilizar biomateriais alternativos e outras características da célula endócrina, tais como a sobrevivência de células e estado de diferenciação.
Introdução
células beta pancreáticas são as únicas células produtoras de insulina no corpo e são essenciais para manter a homeostase da glicose do sangue. Quando os indivíduos saudáveis possuem massa suficiente de células β e funcionar para regular adequadamente a glicose no sangue, indivíduos com diabetes são caracterizados pela insuficiente massa de células β e / ou função de 1,2. Foi proposto que a indução da proliferação de células β em última instância pode aumentar a massa de células β e restaurar a homeostase de glucose em indivíduos com diabetes 3. No entanto, é necessária a avaliação e validação de potenciais compostos de proliferação de células β....
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Protocolo
Todos os procedimentos foram aprovados e executados em conformidade com o Comité de Cuidados e Uso do Vanderbilt Institucional Animal.
1. Rotulagem COI com Fluoróforo (Opcional)
- Escolha um corante fluorescente que irá reagir com uma amina primária livre (por exemplo, numa proteína), tal como ésteres de succinimidilo ou derivados de fluoresceína, para visualizar microesfera de carga. Dissolve-se um excesso molar de 8X (em relação a moles de COI) de fluoróforo em 200 mL de sulfóxido de dimetilo (DMSO).
- Ressuspender 50 mg de COI até um volume final de 800 ul de uma solução de veículo (concentração final de 62,5 ....
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Resultados
A Figura 1 é uma representação visual das microesferas geradas utilizando o protocolo anterior. O protocolo aqui descrito proporciona microesferas rhCTGF-carregada de vários tamanhos. A maior fracção de microsferas vai situar-se entre 1 e 10 um de diâmetro, embora algumas microsferas que podem ser maiores (Figura 2). Se desejado, o tamanho de microsferas pode ser ajustada e optimizada com base em parâmetros de fabrico, tais como velocida.......
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Discussão
O estudo da proliferação de células β em cultura é normalmente prejudicada por várias dificuldades. Em primeiro lugar, as linhas de células imortalizadas β são caracterizados por níveis mais elevados de proliferação do que o que é encontrado em células beta em ilhéus endógenos vivo. Além disso, estas linhas de células imortalizadas não têm a arquitetura normal crítico para a função das células β normal. Estes dois factos fazem com que seja difícil para determinar se os resultados obtidos utilizando linhas de células imo.......
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Divulgações
Os autores não têm nada a divulgar.
Agradecimentos
Os autores gostariam de agradecer a Bethany Carboneau (Vanderbilt University) pela leitura crítica deste manuscrito. Também agradecemos a Anastasia Coldren (Núcleo de Análise e Aquisição de Ilhotas do Centro Médico da Universidade Vanderbilt) pelos isolamentos das ilhotas, e ao Dr. Alvin C. Powers (Centro Médico da Universidade Vanderbilt) e ao Dr. David Jacobson (Universidade Vanderbilt) pelo uso de suas instalações de centrífuga e cultura de tecidos. Esta pesquisa envolveu o uso do Núcleo de Aquisição e Análise de Ilhotas do Centro de Pesquisa e Treinamento em Diabetes Vanderbilt, apoiado por DK20593 de concessão do NIH. Este trabalho foi apoiado por uma bolsa de pó....
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Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| Ácido carboxílico verde de Oregon 488, éster de Succinimidyl, 6 isomer | ThermoFisher Scientific | O6149 | Para rotular o COI com fluoróforo |
| DMSO Dimethyl Sulfoxide | Fisher BioReagents | BP231-1 | Para dissolver o fluoróforo na etapa 1 |
| Colunas de dessalinização PD-10 descartáveis | GE Healthcare | 17-0851-01 | Coluna de dessalinização usada na etapa 1 |
| Resomer RG 505, Poli (D, L-lactide-co-glicolide), éster terminado, peso molecular 54.000 - 69.000 | Sigma-Aldrich | 739960 | Usado na geração de microesferas na etapa 2 |
| Poli (álcool vinílico) peso molecular 89.000 - 98.000 | Sigma-Aldrich | 341584 | Usado na geração de microesferas na etapa 2 |
| RPMI 1640 | Thermo Scientific | 11879-020 | Para ilhotas de cultura |
| Dextrose anidra | Fisher BioReagents | 200-075-1 | Suplemento para meio de ilhotas |
| Penicilina-Estreptomicina | Sigma-Aldrich | P4333 | Antibióticos para meio de ilhotas |
| Soro normal de cavalo | Jackson ImmunoResearch | 008-000-121 | Suplemento para meio de ilhotas |
| Placa de cultura de tecidos de 96 poços | Corning | 3603 | Para ilhéus |
| de culturaÁcido etilenoglico-bis(2-aminoetiléter)-N,N,N',N'-tetracético | Sigma-Aldrich | E4378 | Suplemento para meios de ilhotas pré-ensaio |
| Cytospin 4 Cytocentrifuge | Thermo Scientific | A78300003 | Para células giratórias em lâminas de microscópio |
| EZ Single Cytofunnel | Thermo Scientific | A78710020 | Para células giratórias em lâminas |
| de microscópioÁcido etilenodiaminotetracético | Fisher BioReagents | BP118-500 | Usado na dissociação de ilhotas |
| paraformaldeído | Sigma-Aldrich | P6148 | Para fixar células |
| Triton X-100 | Fisher BioReagents | BP151 | Para células permeabilizantes |
| Soro de burro normal | Jackson ImmunoResearch | 017-000-121 | Reagentes de bloqueio para imunofluorescência |
| Anti-Ki67 anticorpo | abcam | ab15580 | Para imunofluorescência Ki67 |
| Cobaia policlonal Anti-Insulina | Dako | A0564 | Para imunofluorescência de insulina |
| Cy3 AffiniPure Donkey Anti-Rabbit | Jackson ImmunoResearch | 711-165-152 | Para imunofluorescência Ki67 |
| Cy5 AffiniPure Donkey Anti-Guinea Pig | Jackson ImmunoResearch | 706-175-148 | Para imunofluorescência de insulina |
| DAPI (4',6-Diamidino-2-Fenilindo, Dicloridrato) | ThermoFisher Scientific | D1306 | Para visualização de núcleos em imunofluorescência |
| Aqua-Mount | Lerner Laboratories | 13800 | Mídia de montagem de secagem rápida |
| FreeZone -105 ° C 4,5 litros Cascade Benchtop Freeze Dry System | Labconco | 7382020 | Para liofilização de microesferas |
Referências
- Butler, A. E., et al. Beta-cell deficit and increased beta-cell apoptosis in humans with type 2 diabetes. Diabetes. 52 (1), 102-110 (2003).
- Levy, J., Atkinson, A. B., Bell, P. M., McCance, D. R., Hadden, D. R.
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Reimpressões e permissões
