Apresentamos protocolos para coleta, preparação e imagem de oócitos maduros de Drosophila. Esses métodos permitem a visualização do comportamento cromossômico e da montagem e função do fuso durante a meiose.
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Artigo de método
Técnicas de imagem Prometáfase e Metaphase da meiose I em Fixed
Neste artigo
Resumo
Resumo
A segregação cromossômica em oócitos humanos é propensa a erros, resultando em aneuploidia, que é a principal causa genética de aborto espontâneo e defeitos congênitos. O estudo do comportamento cromossômico em oócitos de organismos modelo é muito promissor para descobrir a base molecular da suscetibilidade de oócitos humanos à aneuploidia. Drosophila melanogaster é passível de manipulação genética, com mais de 100 anos de pesquisa, comunidade e desenvolvimento de técnicas. A visualização do comportamento cromossômico e da montagem do fuso em oócitos de Drosophila tem desafios particulares, no entanto, devido principalmente à presença de membranas ao redor do oócito que são impenetráveis aos anticorpos. Descrevemos aqui protocolos para a coleta, preparação e imagem da montagem do fuso da meiose I e do comportamento cromossômico em oócitos de Drosophila, que permitem a dissecção molecular da segregação cromossômica neste importante organismo modelo.
Introdução
O estudo da meiose às vezes é descrito como a "genética da genética". Isso ocorre porque as propriedades fundamentais da herança cromossômica e do sortimento independente são realizadas por meio da segregação dos cromossomos durante a produção dos gametas. Uma demonstração importante da teoria cromossômica da herança veio em 1916 do trabalho de Calvin Bridges em Drosophila melanogaster1. Este e outros estudos de genética clássica em Drosophila contribuíram muito para nossa compreensão da genética. O exame citológico de cromossomos meióticos em oócitos de Drosophila, no entanto, tem sido um desafio. Isso ocorre principalmente porqu....
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Protocolo
Nota: Os procedimentos são realizados à temperatura ambiente a menos que indicado de outra maneira. incubadoras de temperatura controlada são usados para manter as temperaturas para criação mosca e cruza salvo indicação em contrário.
1. Preparações
- Prepare Moscas.
- Prometáfase enriquecido coleções de ovócitos.
- Limpar moscas adultas a partir saudáveis, jovens de ações ou transversais culturas. garrafas de idade para dois dias a 25 ° C.
Nota: Geralmente duas garrafas saudáveis serão suficientes, embora mais podem ser necessários para algumas culturas cruzadas. - Após dois dias, recolher ~ 100 a 300 (fêmeas que são ....
- Limpar moscas adultas a partir saudáveis, jovens de ações ou transversais culturas. garrafas de idade para dois dias a 25 ° C.
- Prometáfase enriquecido coleções de ovócitos.
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Resultados
Os métodos que descrevemos aqui resultará na coleta de oócitos em estágio final de Drosophila representam três fases da meiose (Figura 1). Os oócitos na profase distinguem-se pela presença do envelope nuclear, que é visível pela falta de sinal de tubulina na região em torno do cariossomo (Figura 1A). Prometáfase é o período após nuclear quebra envelope durante o qual os monta fuso. Durante prometáfase, o cariossomo assume uma forma distinta, tor.......
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Discussão
Staging Drosophila Oócitos
Embora um cariossomo alongada é muitas vezes visto em oócitos prometáfase, usando cariossomo forma de distinguir prometáfase a partir de oócitos metafase pode ser problemático. Durante prometáfase, o cariossomo começa como uma forma redonda, alonga, e, em seguida, se retrai para uma forma redonda como o oócito se aproxima da prisão metáfase. Isto significa que muitos oócitos prometáfase não tem uma cariossomo alongado. Além disso, se os oó.......
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Divulgações
Os autores não têm nada a divulgar.
Agradecimentos
Agradecemos a Christian Lehner por fornecer o anticorpo CENP-C e a Eric Joyce por recomendações sobre FISH. O trabalho no laboratório McKim foi financiado por uma bolsa do NIH (GM101955).
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Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| Tubos cônicos de 15 ml | Vários | ||
| formaldeído a 16% Ted | Pella, Inc. | 18505 | PERIGOSO; uma vez aberto, descartar após um mês |
| Copos de 250 ml | Vários | ||
| tubos de 5 ml | Vários | ||
| fermentos secos ativos | Vários | misturam com água para fazer uma pasta com a consistência de | |
| anticorpo anti-alfa;-tubulina | clone DM1A | Sigma | F2168 |
| Sigma | B1186 | Misturador PERIGOSO | |
| Várias | |||
| albuminas de soro bovino | Sigma | A4161 | |
| Várias | |||
| colchicinas | Sigma | C-9754 | LAMÍNULAS |
| PERIGOSAS | VWR | 48366-227 | No. 1 1/2 |
| sulfato de dextrano | Vários | ||
| DMSO | Vários | ||
| EGTA | Vários | ||
| etanol | Várias | ||
| pinças | Ted Pella, Inc. | 5622 | Dumont pinças de alta precisão grau estilo 5 |
| formamida | Sigma | 47670-250ML-F | |
| lâminas de vidro | VWR | 48312-003 | |
| glicose | Vários | ||
| tubos graduados de 1,5 ml | Vários | ||
| HEPES | VWR | EM-5330 | disponíveis em vários vendedores |
| Hoechst 33342 | Vários | ||
| cloreto de magnésio | Vários | ||
| metanol | Várias | ||
| malhas grandes (~ 1.500 µ m) | VWR | AA43657-NK | variedade de formatos e outros fornecedores, malha pequena de 12 ou 14 malhas |
| (~300 µ m) | Spectrum labs | 146 424 | variedade de formatos, e.g., 146 422 ou 146 486 |
| nutator | Várias | ||
| pipetas de Pasteur | Acetato de potássio diverso | ||
| Ácido cacodílico | Sigma | ||
| hidróxido Vários | |||
| acetato de sódio | Vários | ||
| cloreto de sódio | Vários | ||
| citrato de sódio | Vários | ||
| hidróxido de sódio | Vários | ||
| sacarose | Vários | ||
| taxol (paclitaxel) | Sigma | T1912 | PERIGOSO |
| Triton X-100 | Fisher | PI-28314 | |
| Tween 20 | Fisher | PI-28320 | |
| vórtice | Vários |
Referências
- Bridges, C. B. Non-disjunction as proof of the chromosome theory of heredity. Genetics. 1 (1), 1-52 (1916).
- Hassold, T., Hunt, P. To err (meiotically) is human: the genesis of human aneuploidy. Nat Rev Genet. 2 (4), 280-291 (2001).
- Theurkauf, W. E., Ha....
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Reimpressões e permissões
