Fabricación y entrega de medicamentos Aplicaciones de seda nanopartículas

Summary

Las nanopartículas están emergiendo sistemas de administración de fármacos como prometedores para una amplia gama de indicaciones. A continuación, describimos un método simple pero potente para la fabricación de nanopartículas de seda usando seda Bombyx mori ingeniería inversa. Estas nanopartículas de seda pueden ser cargados fácilmente con una carga útil terapéutica y posteriormente exploradas para aplicaciones de administración de fármacos.

Abstract

La seda es un biopolímero prometedor para aplicaciones biomédicas y farmacéuticas debido a su excelente propiedades mecánicas, la biocompatibilidad y biodegradabilidad, así como su capacidad para proteger y posteriormente liberar su carga útil en respuesta a un disparador. Mientras que la seda se puede formular en varios formatos de materiales, las nanopartículas de seda están emergiendo sistemas de administración de fármacos como prometedores. Por lo tanto, este artículo se refiere a los procedimientos de capullos de seda de ingeniería inversa, para dar una solución de seda regenerada que se puede utilizar para generar nanopartículas de seda estables. Estas nanopartículas se caracterizan posteriormente, el fármaco cargado y explorado como un sistema de administración de fármacos contra el cáncer potencial. En pocas palabras, los capullos de seda son técnicas de ingeniería inversa por primera vez por el desgomado los capullos, seguido por disolución de seda y limpiar, para producir una solución acuosa de seda. A continuación, la solución de seda regenerada se somete a nanoprecipitation para producir nanopartículas de seda – un método simple pero potenteque genera nanopartículas uniformes. Las nanopartículas de seda se caracterizan de acuerdo a su tamaño, el potencial zeta, la morfología y la estabilidad en medios acuosos, así como su capacidad para atrapar una carga útil quimioterapéutico y matar las células de cáncer de mama humanos. En general, la metodología descrita produce nanopartículas de seda uniformes que se pueden explorar fácilmente para una gran variedad de aplicaciones, incluyendo su uso como un nanomedicina potencial.

Introduction

Los sistemas de administración de fármacos de tamaño nanométrico se utilizan a menudo para controlar la liberación del fármaco y para entregar un conjunto diverso de cargas útiles terapéuticos – por ejemplo, proteínas, péptidos y fármacos de bajo peso molecular – para apuntar las células y tejidos. Estas cargas útiles terapéuticos se incorporan a menudo en varios vehículos de fármacos macromoleculares, tales como liposomas, polímeros solubles en agua (incluyendo dendrímeros), y micro y nanopartículas ^1. Las nanopartículas (típicamente en un intervalo de tamaño de 1 nm a 1.000 nm) están siendo ampliamente exploradas como posibles portadores de fármacos, en particular para la administración de fármacos contra el cáncer ^2. La introducción exitosa de Abraxane (120 nanopartículas a base de albúmina de tamaño nm cargados con paclitaxel) en la práctica clínica habitual ³ ha catalizado el campo, por lo que muchas más nanopartículas para la administración de fármacos están entrando ahora en ensayos clínicos ^4. Los tumores sólidos en general, muestran un mal drenaje linfático y tienen vasos sanguíneos que gotean que significa que nanoparticles de hasta 200 nm se pasivamente dirigidos a estos tumores después de la administración intravenosa. Este fenómeno de orientación pasiva se llama la permeabilidad mejorada y retención de efecto (EPR) y se informó por primera vez en 1986 ^5. El efecto EPR puede conducir a un aumento de 50 a 100 veces en las concentraciones de fármaco dentro del microambiente del tumor para una dosis de fármaco dada cuando la carga útil fármaco se administra utilizando un enfoque de soporte del fármaco macromolecular en lugar de el fármaco libre sin el portador. Nanopartículas cargadas con fármaco-diseñadas para la administración de fármacos contra el cáncer tienen que alcanzar el microambiente tumoral y, a menudo deben introducir un compartimiento intracelular específica, por lo general mediante la captación endocítica, para el fármaco para lograr su efecto terapéutico deseado ^3. Las nanopartículas diseñadas para la administración de fármacos intracelular explotan endocitosis como puerta de entrada en la célula, así como una ruta para superar los mecanismos de resistencia a fármacos. La liberación del fármaco a partir de nanopartículas es a menudo diseñados específicamente para oCCur en los lisosomas (es decir, la administración de fármacos lysosomotropic) ^6, donde la capacidad de respuesta del pH de la portadora de nanopartículas (lisosomal pH aproximadamente 4,5) puede servir como detonante de liberación de fármacos o enzimas lisosomales que liberan la carga útil del portador ^7.

Muchas clases diferentes de materiales se pueden utilizar para generar las nanopartículas (por ejemplo, metales y muchos materiales orgánicos e inorgánicos). Sin embargo, los biopolímeros están surgiendo como materiales atractivos debido a su biocompatibilidad conocida, biodegradabilidad y baja toxicidad ^8. Muchos biopolímeros están siendo explorados, incluyendo la albúmina, alginato, quitosano y seda. De éstos, la seda se ha convertido en un contendiente prometedor para el desarrollo en los sistemas de administración de fármacos ^9. Las sedas de diversos tipos son producidos por un número de artrópodos, como arañas (por ejemplo, Nephila clavipes) y gusanos de seda (por ejemplo, Bombyx mori). la seda del gusano de seda se utiliza mucho más extenvamente que la seda de araña, porque el gusano de seda está totalmente domesticado y por lo tanto su seda representa un material de partida reproducible. la seda del gusano de seda es una Administración de Alimentos y Medicamentos (FDA) ha aprobado un plan para el uso humano, en particular como material de sutura; que tiene un historial de seguridad robusta en los seres humanos y se sabe que degradan in vivo ^10. El perfil de degradación de la seda puede ser afinado en un rango de horas (de seda cristalina bajo) a 12 meses o más (seda muy cristalino). Productos de degradación de seda son no tóxicos y se metabolizan en el cuerpo ^10. La estructura de seda imparte la capacidad de unirse compuestos de peso molecular pequeñas y fármacos de proteínas macromoleculares ^11, por lo que es un buen material para liberación controlada de fármacos. Fármacos de proteínas (por ejemplo, anticuerpos) son susceptibles a la desnaturalización, agregación, escisión proteolítica y el aclaramiento por el sistema inmune. Sin embargo, la seda se estabiliza proteínas terapéuticas debido a la capacidad de amortiguación de su re nanocristalinaregiones y su capacidad de adaptar el contenido de agua en la nanoescala ^11. Estas características únicas proporcionan protección física y reducen la movilidad de carga útil ¹¹ y por lo general no se ven con otros (bio) polímeros. Muchos sistemas de suministro de fármacos contra el cáncer, por ejemplo hidrogeles basados en seda ^12, películas ^13-15 y nanopartículas ^16,17, ahora se han desarrollado para aprovechar estas características (revisado en las referencias ^18,19)

Aquí, las nanopartículas de seda se caracterizaron mediante la determinación de su tamaño y carga sobre un marco de tiempo prolongado. La doxorrubicina, un fármaco contra el cáncer clínicamente relevante, se utilizó como un fármaco modelo para estudios de carga de drogas y de citotoxicidad en células de cáncer de mama humano triple negativos tratados con nanopartículas de seda cargados con el fármaco.

Protocol

1. Preparación de una solución de ingeniería inversa de seda de Bombyx mori capullos NOTA: Esta metodología se basa en protocolos descritos en otras partes 12,27. Cortar 5 g de capullos secos con unas tijeras en 5 mm x 5 mm pedazos. Retire cualquier capas sucias. Pesar 4,24 g de carbonato de sodio y añadir esta cuidadosamente para 2 l de agua destilada hirviendo. NOTA: Esto produce una solución de carbonato 0,02 M de sodio. Añadir los trozos de cor…

Representative Results

Los datos se analizaron estadísticamente como se detalla anteriormente 17. Se utilizó la prueba t de Student para pares de muestras y análisis unidireccional de la varianza (ANOVA) seguido de comparaciones múltiples de Bonferroni test post hoc de múltiples muestras. El asterisco indica significación estadística de la siguiente manera: * P <0,05 y ** P <0,001. Todos los datos se presentan como valores medios ± desviación estándar (SD) y los números entre parén…

Discussion

Están disponibles diversos métodos para producir nanopartículas de seda, incluyendo el alcohol de polivinilo combinando ^20, secando por pulverización ^{21, 22} desalado, micropuntos capilar de impresión ^23, _CO2 supercrítico precipitación ²⁴ y nanoprecipitation ^16,25 (revisado en la referencia ^26). Sin embargo, nanoprecipitation, debido a su simplicidad general, es la técnica más popular para la generación de nanopartículas de…

Materials

Acetone	VWR International, Radnor, PA, USA	20066.33
Automated Critical Point Dryer	Leica Microsystems, Wetzlar, Germany	EM CPD300
Balancing	Mettler Toledo, Greifensee, Switzerland	NewClassic MS
Black polystyrene microplate , 96 well	Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA	3991
Capillary cell (DTS 1070)	Malvern Instrument, Worcestershire, UK	DTS107
Carbon adhesive disc	Agar Scientific, Essex, UK	G3347N
Centrifuge	Hermle Labortechnik, Wehingen, Germany	Z323K
Centrifuge	Beckman Coulter, Brea, CA, USA	Avanti J-E, Rotor: J20
Centrifuge	Beckman Coulter, Brea, CA, USA	Optima L-70K, Rotor: 50.2 Ti, Adaptor 303392
Coater, low vacuum	Leica Microsystems, Wetzlar, Germany	EM ACE200
Cuvettes, polystyrene, disposable	Fisher Scientific, Waltham, MA, USA	FB55147
Doxorubixin	LC Laboratories, Boston, MA, USA	D4000
Electronic pipetting, Easypet	Eppendorf, Hamburg, Germany	N/A
FE-SEM	Hitachi High-Technologies, Krefeld, Germany	SU6600
Fetal Bovine Serum	Thermo Scientific, Waltham, MA, USA	16000-044
Freeze dryer	Martin Christ, Osterode, Germany	Epsilon 2-4
Heat inactivated Bombyx mori silk cocoons	Tajima Shoji, Kanagawa, Japan	N/A
Hotplate with Stirrer	Bibby Scientific, Stanffordshire, UK	US 152
Incubator	Memmert, Schwabach, Germany	INB 200
Insulin, human recombinant, zinc solution	Thermo Scientific, Waltham, MA, USA	12585-014
Lithium bromide	Acros Organics, Geel, Belgium	AC199870025
MDA-MB-231	ATCC, Manassas, VA, U.S.A	N/A
Micropipette and tips	Eppendorf, Hamburg, Germany	N/A
Microplate Reader	Molecular devices, Sunnyvale, CA, USA	SpectraMax M5
Oak Ridge High-Speed Centrifuge Tubes, 50 ml	Thermo Scientific, Waltham, MA, USA	N/A
Open-Top Thickwall Polycarbonate tube, 4 ml	Beckman Coulter, Brea, CA, USA	355645
Penicilin/streptomycin	Thermo Scientific, Waltham, MA, USA	15140-122
RPMI medium	Thermo Scientific, Waltham, MA, USA	11875-093
Serological pipettes, 5 ml	Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA
Silicon wafers	Agar Scientific, Essex, UK	G3391
Slide-A-Lyzer Dialysis cassettes, 3.5K MWCO, 15 ml	Thermo Scientific, Waltham, MA, USA	87724
Sodium carbonate anhydrous	Fisher Scientific, Waltham, MA, USA	S/2840/62
Specimen stubs for SEM	Agar Scientific, Essex, UK	G301
Ultrasonic homogenizer	Bandelin, Berlin, Germany	Sonoplus HD 2070
UV transparent microplate, 96 well	Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA	3635
Vortex	IKA, Staufen, Germany	Genius 3
Zetasizer	Malvern Instrument, Worcestershire, UK	Nano ZS
Zetasizer Software version 7.11			DLS software
Micro Modulyo	Thermo Fisher	230	Freeze drying system