Værktøjer til at undersøge, hvilken rolle for Arkitektonisk Protein HMGB1 i behandling af Helix fordrejende, site-specifikke DNA interstrengstværbindinger
Summary
Targeted DNA damage can be achieved by tethering a DNA damaging agent to a triplex-forming oligonucleotide (TFO). Using modified TFOs, DNA damage-specific protein association, and DNA topology modification can be studied in human cells by the utilization of modified chromatin immunoprecipitation assays and DNA supercoiling assays described herein.
Abstract
gruppe kasse høj mobilitet 1 (HMGB1) protein er et ikke-histon arkitektoniske protein, der er involveret i reguleringen af mange vigtige funktioner i genomet, såsom transskription, DNA-replikation, og DNA-reparation. HMGB1 binder til strukturelt forvrænget DNA med højere affinitet end til kanonisk B-DNA. For eksempel fandt vi, at HMGB1 binder til DNA interstrengstværbindinger (ICLs), som kovalent forbinder de to dele af DNA'et, fremkalder en fordrejning af spiralen, og hvis ikke repareres kan forårsage celledød. På grund af deres cytotoksiske potentiale er flere ICL-inducerende midler anvendes for tiden som kemoterapeutiske midler i klinikken. Mens ICL-dannende midler viser præferencer for visse basesekvenser (f.eks 5'-TA-3 'er den foretrukne tværbindende site for psoralen), de i høj grad inducerer DNA-beskadigelse i en vilkårlig måde. Men ved kovalent kobling af ICL-inducerende middel til en triplex-dannende-oligonukleotid (TFO), som binder til DNA i en sekvensspecifikmåde kan målrettet DNA-skade opnås. Her bruger vi en TFO kovalent konjugeret på 5 'enden til en 4'-hydroxymethyl-4,5', 8-trimethylpsoralen (HMT) psoralen til at generere en stedspecifik ICL på en mutation-reporterplasmid at bruge som et værktøj at studere den arkitektoniske ændring, bearbejdning, og reparation af komplekse DNA-læsioner ved HMGB1 i humane celler. Vi beskriver eksperimentelle teknikker til at forberede TFO-rettet ICLs på reporter plasmider, og at afhøre den sammenslutning af HMGB1 med TFO-rettet ICLs i et trådløst sammenhæng ved hjælp kromatin immunopræcipitationsanalyser. Desuden beskriver vi DNA supercoiling assays til vurdering specifik arkitektonisk modifikation af beskadiget DNA ved at måle mængden af superspiraldensitet vindinger indført på psoralen-tværbundne plasmid ved HMGB1. Disse teknikker kan anvendes til at studere de roller, andre proteiner involveret i behandling og reparation af TFO rettede ICLs eller andre målrettede DNA-beskadigelse i nogen cellelinie af interesse.
Introduction
Triplex-dannende oligonukleotider (TFO'er) binder duplex-DNA i en sekvens-specifik måde via Hoogsteen-hydrogenbinding til dannelse triple-spiralformede strukturer 1-5. Triplex teknologi er blevet anvendt til at forespørge en række biomolekylære mekanismer, såsom transskription, DNA beskadigelse reparation, og gen-targeting (gennemgået i referencerne 6-8). TFO'er stor udstrækning blevet anvendt til at inducere stedspecifik skade på reporterplasmider 9,10. Vores laboratorium og andre har tidligere brugt en TFO, AG30, bundet til en psoralen molekyle til at fremkalde stedspecifikke DNA interstrengstværbindinger (ICLs) i supF genet på plasmidet pSupFG1 5,10-12. ICLs er meget cytotoksisk som disse læsioner kovalent tværbinde to DNA-strenge, og hvis ikke repareres, kan blokere gentranskription og hindre DNA-replikation maskiner 13,14. På grund af deres cytotoksiske potentiale, har ICL-inducerende midler blevet anvendt som kemoterapeutiske lægemidler i behandlingenaf cancer og andre sygdomme 15. Imidlertid er behandling og reparation af ICLs i humane celler ikke godt forstået. Således kan en bedre forståelse af de involverede i behandlingen af ICLs i humane celler mekanismer bidrage til at forbedre effektiviteten af ICL-baserede kemoterapeutiske regimer. TFO-inducerede ICLs og deres reparation mellemprodukter har potentiale til at forårsage betydelige strukturelle forvridninger til DNA helix. Sådanne fordrejninger er sandsynlige mål for arkitektoniske proteiner, som binder til forvrængede DNA med højere affinitet end til kanonisk B-formen duplex DNA 16-20. Her undersøgte vi foreningen af en meget rigelig arkitektonisk protein, HMGB1 med ICLs i humane celler via chromatin immunoprecipitation (chip) assays på psoralen-tværbundet plasmider og identificeret en rolle for HMGB1 i modulering topologien af psoralen-tværbundne plasmid-DNA i humant cancer cellelysater.
HMGB1 er en meget rigelige og ubikvitært ikke-hanstone arkitektonisk protein, der binder til beskadiget DNA og alternativt strukturerede DNA substrater med højere affinitet end kanonisk B-formen DNA 17-20. HMGB1 er involveret i flere DNA metaboliske processer, såsom transcription, DNA-replikation, og DNA-reparation 16,21-23. Vi har tidligere vist, at HMGB1 binder til TFO rettede ICLs in vitro med høj affinitet 20. Endvidere har vi vist, at mangel på HMGB1 steg den mutagene behandling af TFO rettede ICLs og identificeret HMGB1 som et nukleotid excision reparation (NER) cofaktor 23,24. For nylig har vi fundet, at HMGB1 er associeret med TFO rettede ICLs i humane celler og dets rekruttering til sådanne læsioner er afhængig af NER protein, XPA 16. Negativ supercoiling af DNA har vist sig at fremme en effektiv fjernelse af DNA-læsioner ved NER 25, og vi har fundet, at HMGB1 inducerer negativ supercoiling fortrinsvis på TFO rettede ICL-holdige plasmidten substrater (i forhold til ikke-beskadigede plasmider substrater) 16, hvilket giver en bedre forståelse af den potentielle rolle (r) af HMGB1 som NER co-faktor. Behandlingen af ICLs er ikke fuldt forstået i humane celler; Således kunne teknikker og assays udviklet på baggrund af de molekylære værktøjer beskrevet heri føre til identifikation af yderligere proteiner involveret i ICL reparation, hvilket igen kan tjene som farmakologiske mål, som kan udnyttes til at forbedre effektiviteten af cancer kemoterapi.
Her, at en effektiv tilgang vurdere effektiviteten af TFO-dirigeret ICL-dannelse i plasmid-DNA ved denaturerende agarosegelelektroforese er blevet diskuteret. Yderligere, ved hjælp af plasmider indeholdende de TFO rettede ICLs, teknikker til bestemmelse associeringen af HMGB1 med ICL-beskadigede plasmider i et cellulært kontekst anvendelse af modificerede chip assays er blevet beskrevet. Derudover en letkøbt metode studere topologiske ændringer, som the arkitektoniske protein HMGB1, specifikt på ICL-beskadigede plasmid substrater i humane cellelysater er blevet bestemt ved at udføre supercoiling assays via todimensional agarosegelelektroforese. De beskrevne teknikker kan anvendes til at fremme forståelsen af at inddrage DNA-reparation og arkitektoniske proteiner i behandlingen af målrettet DNA-skade på plasmider i humane celler.
Vi beskriver detaljerede protokoller for dannelsen af TFO-rettede stedspecifikke psoralen ICLs på plasmid DNA og efterfølgende plasmid chip og supercoiling assays for at identificere proteiner, der associerer med læsioner, og proteiner, der ændrer DNA topologi hhv. Disse assays kan modificeres til at udføre med andre DNA-beskadigende midler, TFO'er plasmid substrater og mammale cellelinier af interesse. Faktisk har vi vist, at der er mindst én potentiel unik og høj affinitet TFO-bindingssted inden for hver kommenteret gen i det humane genom 26. Hvordannogensinde, for klarhed, beskrev vi disse teknikker for anvendelse af en specifik psoralen-konjugeret TFO (pAG30) på en specifik mutation-reporterplasmid (pSupFG1) i humane U2OS celler, som vi har anvendt i Mukherjee & Vasquez 2016 16.
Protocol
Representative Results
Discussion
Den effektive dannelse af TFO rettede ICLs afhænger to afgørende faktorer: For det første, ordentlig pufferkomponenter (f.eks MgCl2) og inkubationstid for TFO med sin mål-DNA-substrat (afhængig af bindingsaffiniteten af TFO til dens mål duplex, og koncentrationerne anvendt); og for det andet, den korrekte dosis af UVA (365 nm) bestråling for at danne psoralen tværbindinger effektivt. Optimal triplex-dannelse kan opnås ved anvendelse af HPLC eller geloprenset TFO'er. Urenheder kontaminere…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Forfatterne vil gerne takke medlemmerne af Vasquez laboratorium for nyttige diskussioner. Dette arbejde blev støttet af National Institutes of Health / National Cancer Institute [CA097175, CA093279 til KMV]; og forebyggelse Cancer og Research Institute of Texas [RP101501]. Støtte til åben adgang gebyr: National Institutes of Health / National Cancer Institute [CA093279 til KMV].
Materials
| 5'HMT Psoralen-AG30 | Midland Certified Reagent Co., Midland, TX | Custom order | HPLC (or gel) purified |
| Simple ChIP Enzymatic Chromatin IP Kit | Cell signaling Inc. | 9003 | Manufacturer suggested protocol is optimized for chromatin IP and not for plasmid IP. The control IgG and H3 antibodies as well as the Protein G beads and micrococcal nuclease are supplied by the manufacturer. |
| GoTaq Green | Promega | M7122 | PCR master mix |
| HMGB1 antibody | Abcam | Ab18256 | |
| Wizard Gel and PCR cleanup kit | Promega | A9281 | |
| Chloroquine-diphosphate salt | Sigma | C6628-50G | For two-dimensional agarose gel electrophoresis |
| EcoRI | New England BioLabs | R0101S | |
| GenePORTER transfection reagent | Genlantis | T201015 | |
| Vaccinia Topoisomerase I | Invitrogen | 38042-024 | |
| Blak-Ray long wave ultraviolet lamp | Upland, CA | B 100 AP | UVA lamp |
| EpiSonic Multi-Functional Bioprocessor 1100 | Epigentek | EQC-1100 | Water bath sonicator |
| Mylar filter | GE Healthcare Life Sciences | 80112939 | |
| Agarose | Sigma-Aldrich | A6111 | |
| BIO-RAD Chemidoc | BIO-RAD | XRS+ system | DNA imaging system |
| Glycine | Fisher Scientific | BP381-500 | |
| 37% Formaldehyde | Sigma-Aldrich | F8775-25ML | Used for crosslinking |
| Proteinase K | New England Biolabs | P8107S | |
| DMEM | ThermoFisher | 11965092 | Cell culture media |
| PBS | ThermoFisher | 70013073 | Cell culture |
| Trypsin-EDTA | ThermoFisher | 25200056 | Cell culture |
| Bromocresol green | Sigma-Aldrich | 114-359 | DNA loading dye |
| Siliconized tubes | Fisher Scientific | 02-681-320 | Low retention microfuge tube |
| Tris base | Fisher Scientific | BP152-1 | |
| Boric Acid | Fisher Scientific | A74-1 | |
| EDTA | Fisher Scientific | BP24731 | |
| Photometer | InternationalLight Technologies | ILT1400-A | UVA dose measurement |
| Cell lines | |||
| Human U2OS osteosarcoma | ATCC | ATCC HTB-96 | Cultured according to supplier’s recommendation |
| Human cervical adenocarcinoma HeLa | ATCC | ATCC-CCL-2 | Cultured according to supplier’s recommendation |
| Proximal forward primer | 5′-gcc ccc ctg acg agc atc ac | ||
| Proximal reverse primer | 5′-tag tta ccg gat aag gcg cag cgg | ||
| Distal forward primer | 5′-aat acc gcg cca cat agc ag | ||
| Distal reverse primer | 5′-agt att caa cat ttc cgt gtc gcc |
Referências
- Moser, H. E., Dervan, P. B. Sequence-specific cleavage of double helical DNA by triple helix formation. Science. 238, 645-650 (1987).
- Cooney, M., Czernuszewicz, G., Postel, E. H., Flint, S. J., Hogan, M. E. Site-specific oligonucleotide binding represses transcription of the human c-myc gene in vitro. Science. 241, 456-459 (1988).
- Beal, P. A., Dervan, P. B. Second structural motif for recognition of DNA by oligonucleotide-directed triple-helix formation. Science. 251, 1360-1363 (1991).
- Vasquez, K. M., Dagle, J. M., Weeks, D. L., Glazer, P. M. Chromosome targeting at short polypurine sites by cationic triplex-forming oligonucleotides. J Biol Chem. 276, 38536-38541 (2001).
- Vasquez, K. M., Christensen, J., Li, L., Finch, R. A., Glazer, P. M. Human XPA and RPA DNA repair proteins participate in specific recognition of triplex-induced helical distortions. Proc Natl Acad Sci U S A. 99, 5848-5853 (2002).
- Mukherjee, A., Vasquez, K. M. Triplex technology in studies of DNA damage, DNA repair, and mutagenesis. Biochimie. 93, 1197-1208 (2011).
- Chin, J. Y., Glazer, P. M. Repair of DNA lesions associated with triplex-forming oligonucleotides. Mol Carcinog. 48, 389-399 (2009).
- Seidman, M. M., Glazer, P. M. The potential for gene repair via triple helix formation. J Clin Invest. 112, 487-494 (2003).
- Vasquez, K. M. Targeting and processing of site-specific DNA interstrand crosslinks. Environ Mol Mutagen. 51, 527-539 (2010).
- Wang, G., Levy, D. D., Seidman, M. M., Glazer, P. M. Targeted mutagenesis in mammalian cells mediated by intracellular triple helix formation. Mol Cell Biol. 15, 1759-1768 (1995).
- Wang, G., Seidman, M. M., Glazer, P. M. Mutagenesis in mammalian cells induced by triple helix formation and transcription-coupled repair. Science. 271, 802-805 (1996).
- Chen, Z., Xu, X. S., Yang, J., Wang, G. Defining the function of XPC protein in psoralen and cisplatin-mediated DNA repair and mutagenesis. Carcinogenesis. 24, 1111-1121 (2003).
- Derheimer, F. A., Hicks, J. K., Paulsen, M. T., Canman, C. E., Ljungman, M. Psoralen-induced DNA interstrand cross-links block transcription and induce p53 in an ataxia-telangiectasia and rad3-related-dependent manner. Mol Pharmacol. 75, 599-607 (2009).
- Vare, D., et al. DNA interstrand crosslinks induce a potent replication block followed by formation and repair of double strand breaks in intact mammalian cells. DNA repair. 11, 976-985 (2012).
- Huang, Y., Li, L. DNA crosslinking damage and cancer – a tale of friend and foe. Transl Cancer Res. 2, 144-154 (2013).
- Mukherjee, A., Vasquez, K. M. HMGB1 interacts with XPA to facilitate the processing of DNA interstrand crosslinks in human cells. Nucleic Acids Res. 44, 1151-1160 (2016).
- Bidney, D. L., Reeck, G. R. Purification from cultured hepatoma cells of two nonhistone chromatin proteins with preferential affinity for single-stranded DNA: apparent analogy with calf thymus HMG proteins. Biochem Biophys Res Commun. 85, 1211-1218 (1978).
- Bianchi, M. E., Beltrame, M., Paonessa, G. Specific recognition of cruciform DNA by nuclear protein HMG1. Science. 243, 1056-1059 (1989).
- Jung, Y., Lippard, S. J. Nature of full-length HMGB1 binding to cisplatin-modified DNA. Bioquímica. 42, 2664-2671 (2003).
- Reddy, M. C., Christensen, J., Vasquez, K. M. Interplay between human high mobility group protein 1 and replication protein A on psoralen-cross-linked DNA. Bioquímica. 44, 4188-4195 (2005).
- Das, D., Scovell, W. M. The binding interaction of HMG-1 with the TATA-binding protein/TATA complex. J Biol Chem. 276, 32597-32605 (2001).
- Little, A. J., Corbett, E., Ortega, F., Schatz, D. G. Cooperative recruitment of HMGB1 during V(D)J recombination through interactions with RAG1 and DNA. Nucleic Acids Res. 41, 3289-3301 (2013).
- Lange, S. S., Mitchell, D. L., Vasquez, K. M. High mobility group protein B1 enhances DNA repair and chromatin modification after DNA damage. Proc Natl Acad Sci U S A. 105, 10320-10325 (2008).
- Lange, S. S., Reddy, M. C., Vasquez, K. M. Human HMGB1 directly facilitates interactions between nucleotide excision repair proteins on triplex-directed psoralen interstrand crosslinks. DNA repair. 8, 865-872 (2009).
- Park, J. Y., Ahn, B. Effect of DNA topology on plasmid DNA repair in vivo. FEBS letters. , 174-178 (2000).
- Wu, Q., et al. High-affinity triplex-forming oligonucleotide target sequences in mammalian genomes. Mol Carcinog. 46, 15-23 (2007).
- Sheflin, L. G., Spaulding, S. W. High mobility group protein 1 preferentially conserves torsion in negatively supercoiled DNA. Bioquímica. 28, 5658-5664 (1989).
- Betous, R., et al. Role of TLS DNA polymerases eta and kappa in processing naturally occurring structured DNA in human cells. Mol Carcinog. 48, 369-378 (2009).
- Luo, Z., Macris, M. A., Faruqi, A. F., Glazer, P. M. High-frequency intrachromosomal gene conversion induced by triplex-forming oligonucleotides microinjected into mouse cells. Proc Natl Acad Sci U S A. 97, 9003-9008 (2000).
- Vasquez, K. M., Wang, G., Havre, P. A., Glazer, P. M. Chromosomal mutations induced by triplex-forming oligonucleotides in mammalian cells. Nucleic Acids Res. 27, 1176-1181 (1999).
- Puri, N., et al. Minimum number of 2′-O-(2-aminoethyl) residues required for gene knockout activity by triple helix forming oligonucleotides. Bioquímica. 41, 7716-7724 (2002).
- Christensen, L. A., Finch, R. A., Booker, A. J., Vasquez, K. M. Targeting oncogenes to improve breast cancer chemotherapy. Cancer Res. 66, 4089-4094 (2006).
- Boulware, S. B., et al. Triplex-forming oligonucleotides targeting c-MYC potentiate the anti-tumor activity of gemcitabine in a mouse model of human cancer. Mol Carcinog. 53, 744-752 (2014).
