Tools, um die Rolle der Architektur-Protein HMGB1 zur Untersuchung bei der Verarbeitung von Helix verzerrenden, ortsspezifische DNA-Quervernetzungen zwischen

Summary

Targeted DNA damage can be achieved by tethering a DNA damaging agent to a triplex-forming oligonucleotide (TFO). Using modified TFOs, DNA damage-specific protein association, and DNA topology modification can be studied in human cells by the utilization of modified chromatin immunoprecipitation assays and DNA supercoiling assays described herein.

Abstract

High-Mobility-Group-Box 1 (HMGB1) Protein ein Nicht-Histon-Protein, das in Architektur Regulieren viele wichtige Funktionen im Genom, wie beispielsweise Transkription, DNA-Replikation und DNA-Reparatur beteiligt ist. HMGB1 bindet strukturell verzerrten DNA mit einer höheren Affinität als zu kanonischen B-DNA. Beispielsweise fanden wir, dass HMGB1 bindet an DNA Interstrang-Vernetzungen (ICLs), die die beiden Stränge der DNA kovalent verknüpfen, Verzerrung der Wendel verursachen und nicht reparierten wenn links kann zum Zelltod führen. Aufgrund ihrer zytotoxische Potential sind mehrere ICL auslösende Mittel, die gegenwärtig als chemotherapeutische Mittel in der Klinik eingesetzt. Während ICL bildende Mittel Präferenzen für bestimmte Basensequenzen zeigen (zB 5'-TA-3 'ist die bevorzugte Vernetzungsstelle für Psoralen), DNA – Schäden in einer wahllos Art und Weise sie weitgehend induzieren. Jedoch durch kovalentes Koppeln des ICL-induzierenden Mittels zu einem Triplex Forming Oligonucleotid (TFO), die in einer sequenzspezifischen DNA bindetWeise gezielte DNA-Schädigung erreicht werden. Hier verwenden wir einen TFO kovalent auf der 'Ende zu einem 4'-Hydroxymethyl-4,5' 5 konjugiert, 8-trimethylpsoralen (HMT) Psoralen eine ortsspezifische ICL auf einem mutations Reporterplasmid zu erzeugen als ein Werkzeug zu verwenden, die architektonische Modifizierung, Verarbeitung und Reparatur von DNA-Komplex Läsionen durch HMGB1 in menschlichen Zellen zu untersuchen. Wir beschreiben experimentelle Techniken TFO-gerichtete ICLs auf Reporter-Plasmide herzustellen, und die Assoziation von HMGB1 mit den TFO-gerichtete ICLs in einem zellulären Kontext mit Chromatinimmunpräzipitation Assays zu verhören. Ferner beschreiben wir DNA-Supercoiling Assays spezifische architektonische Modifikation des beschädigten DNA zu bewerten, indem die Menge der superhelikalen Windungen Messung auf dem Psoralen-vernetzt Plasmid durch HMGB1 eingeführt. Diese Techniken können verwendet werden, um die Rollen von anderen Proteinen in der Verarbeitung und Reparatur von TFO-directed ICLs oder anderen zielgerichteten DNA-Schäden in jeder Zelllinie von Interesse beteiligt zu studieren.

Introduction

Triplex Forming Oligonucleotide (TFOs) bind duplex DNA in einer sequenzspezifischen Art und Weise via Hoogsteen-Wasserstoffbrückenbindung tripelhelicalen ^1-5 Strukturen zu bilden. Triplex – Technologie verwendet, um eine Vielzahl von biomolekularen Mechanismen, wie Transkription, DNA – Schäden zu reparieren, und Gen – Targeting ( zusammengefasst in Referenzen ^6-8) zu befragen. TFOs wurden ^9,10 ausgiebig zu induzieren ortsspezifische Schäden an Reporter – Plasmide verwendet. Unser Labor und andere haben bislang auf einer TFO, AG30, gebunden an ein Psoralen Molekül ^5,10-12 ortsspezifische DNA – Quervernetzungen zwischen (ICL) im supF – Gen auf dem Plasmid pSupFG1 zu induzieren. ICLs sind hochcytotoxisch wie diese Läsionen kovalente Verknüpfung der beiden DNA – Stränge zu vernetzen, und wenn nicht repariert, kann Gen – Transkription blockieren und die DNA – Replikationsmaschinerie ^13,14 behindern. Wegen ihres zytotoxischen Potentials ICL-induzierende Mittel wurden als chemotherapeutische Wirkstoffe in der Behandlung verwendetvon Krebs und anderen Krankheiten , ^15. Jedoch ist die Bearbeitung und die Reparatur von ICLs in menschlichen Zellen nicht gut verstanden. So kann ein besseres Verständnis der bei der Verarbeitung von ICLs Mechanismen in menschlichen Zellen helfen, die Wirksamkeit der ICL-basierten chemotherapeutischen Therapien zu verbessern. TFO-induzierte ICLs und deren Reparatur Zwischenprodukte haben das Potenzial, erhebliche strukturelle Verzerrungen bei der DNA-Helix zu verursachen. Solche Verzerrungen sind wahrscheinlich Ziele für architektonische Proteine, die mit einer höheren Affinität zu verzerrten DNA binden als an kanonischen B-Form Duplex – DNA – ^16-20. Hier untersuchten wir die Assoziation eines hoch reichlich architektonischen Protein HMGB1 mit ICLs in menschlichen Zellen durch Chromatin-Immunopräzipitation (ChIP) Assays auf Psoralen netzten Plasmiden und identifiziert eine Rolle für HMGB1 in Modulieren der Topologie des Psoralen netzten Plasmid DNA in menschlichen Krebs Zelllysaten.

HMGB1 ist ein sehr reichlich vorhanden und ubiquitär exprimiert nicht seinTon architektonischen Protein , das als ^17-20 DNA kanonischen B-Form , um beschädigte DNA und alternativ strukturierten DNA – Substrate mit einer höheren Affinität bindet. HMGB1 ist ^16,21-23 in mehreren DNA – Stoffwechselprozesse, wie beispielsweise Transkription, DNA – Replikation und DNA – Reparatur beteiligt. Wir haben zuvor gezeigt , dass HMGB1 bindet an TFO-directed ICLs in vitro mit hoher Affinität ^20. Gerichtet TFO-ICLs und identifiziert HMGB1 als Nukleotidexzisionsreparatur (NER) Cofaktor ^23,24 weiteren haben wir gezeigt , dass der Mangel an HMGB1 des mutagenen Verarbeitung erhöht. Vor kurzem haben wir festgestellt , dass mit HMGB1 TFO-directed ICLs in menschlichen Zellen und ihre Einstellung auf solche Läsionen auf dem NER – Protein, XPA ¹⁶ abhängig zugeordnet ist. Negative Supercoiling von DNA wurde von NER ^25, und wir haben festgestellt , die effiziente Entfernung von DNA – Läsionen zu fördern gezeigt , dass HMGB1 negativen supercoiling induziert bevorzugt auf TFO-directed ICL enthaltenden plasmid Substrate (bezogen auf nicht-beschädigten Plasmiden Substrate) ^16, um ein besseres Verständnis der möglichen Rolle (n) von HMGB1 als NER Cofaktor bereitstellt. Die Verarbeitung von ICLs ist nicht vollständig in menschlichen Zellen zu verstehen; Somit entwickelt die Techniken und Assays auf der Basis der molekularen Werkzeugen hierin beschrieben könnte in ICL-Reparatur beteiligt zur Identifikation von zusätzlichen Proteinen führen, die wiederum dienen als pharmakologische Ziele, die ausgenutzt werden können, um die Wirksamkeit von Krebs-Chemotherapie zu verbessern.

Hierbei ist ein wirksamer Ansatz, die Effizienz der TFO-directed ICL Bildung in Plasmid-DNA zu beurteilen durch Agarosegelelektrophorese denaturierenden diskutiert. Ferner Techniken unter Verwendung der Plasmide, die die TFO-gerichtete ICLs enthält, die Assoziation von HMGB1 mit ICL geschädigten Plasmide in einem zellulären Kontext mit modifizierten ChIP Assays zu bestimmen, wurden beschrieben. Zusätzlich zu eine einfache Methode topologische Modifikationen durch th eingeführt studierene architektonischen Protein HMGB1, insbesondere on-ICL beschädigt Plasmid Substrate in menschlichen Zell-Lysaten wurde durch Durchführung supercoiling Assays über zweidimensionale Agarose-Gelelektrophorese bestimmt. Die beschriebenen Techniken können das Verständnis der Beteiligung von DNA-Reparatur und architektonischen Proteine ​​in der Verarbeitung von gezielten DNA-Schädigung auf Plasmiden in menschlichen Zellen zu fördern verwendet werden.

Wir beschreiben detaillierte Protokolle für die Bildung von TFO-gerichtete ortsspezifische Psoralen ICLs auf Plasmid-DNA und anschließende Plasmid ChIP und Supercoiling Assays Proteine ​​zu identifizieren, die mit den Läsionen assoziiert, und Proteine, die die DNA-Topologie zu verändern, respectively. Diese Assays können modifiziert werden, um mit anderen DNA-schädigenden Mitteln durchzuführen, TFOs Plasmid Substrate und Säugerzelllinien von Interesse. In der Tat haben wir gezeigt , dass es mindestens eine potentielle einzigartige und hochaffinen TFO-Bindungsstelle innerhalb jedes kommentierten Gen im menschlichen Genom ist ^26. Wiehaupt, aus Gründen der Klarheit beschrieben wir diese Techniken für die Verwendung eines spezifischen Psoralen-konjugiertes TFO (pAG30) auf einer spezifischen Mutation Reporterplasmid (pSupFG1) in menschlichen U2OS – Zellen , wie wir in Mukherjee & Vasquez 2016 ¹⁶ genutzt haben.

Protocol

1. Herstellung von TFO-directed ICLs auf Plasmid Substrate Inkubieren äquimolaren Mengen von Plasmid pSupFG1 10,11 DNA (5 ug Plasmid – DNA ist ein guter Ausgangspunkt) mit Psoralen-konjugiertes TFO AG30 in 8 ul von Triplex Bindungspuffer [50% Glycerin, 10 mM Tris (pH 7,6), 10 mM MgCl 2] und dH 2 O auf ein Endvolumen von 40 ul in einem bernsteinfarbenen Röhre. Gut mischen durch Pipettieren von oben und unten. Inkubieren der Reaktion bei 37 ° C Wasserbad für 12 Stunden. </li…

Representative Results

Bildung des TFO-directed ICL ist kritisch für die Plasmid-basierte Assays, die verwendet werden, um die Rollen von architektonischen Proteine ​​in ICL Verarbeitung in menschlichen Zellen zu befragen. denaturierender Agarosegelelektrophorese ist ein facile Weg, um die Effizienz der TFO-directed ICL Formation zu bestimmen. Die Plasmide TFO-gerichtete ICLs beherbergen wandern mit einer geringeren Mobilität durch die Agarosegelmatrix (1A, Spur 3) im Vergleich zu den ni…

Discussion

Die effiziente Bildung von TFO-directed ICLs hängt von zwei entscheidenden Faktoren: Erstens richtigen Pufferkomponenten (zB MgCl ₂₎ und die Zeit der Inkubation des TFO mit seiner Ziel – DNA – Substrat (abhängig von der Bindungsaffinität des TFO an seine Ziel duplex, und die Konzentrationen verwendet werden); und zweitens, die richtige Dosis an UVA (365 nm) Bestrahlung Psoralen Vernetzungen effizient bilden. Optimale Triplex-Bildung kann durch die Verwendung HPLC oder gelgereinigt TFOs erreicht we…

Materials

5'HMT Psoralen-AG30	Midland Certified Reagent Co., Midland, TX	Custom order	HPLC (or gel) purified
Simple ChIP Enzymatic Chromatin IP Kit	Cell signaling Inc.	9003	Manufacturer suggested protocol is optimized for chromatin IP and not for plasmid IP. The control IgG and H3 antibodies as well as the Protein G beads and micrococcal nuclease are supplied by the manufacturer.
GoTaq Green	Promega	M7122	PCR master mix
HMGB1 antibody	Abcam	Ab18256
Wizard Gel and PCR cleanup kit	Promega	A9281
Chloroquine-diphosphate salt	Sigma	C6628-50G	For two-dimensional agarose gel electrophoresis
EcoRI	New England BioLabs	R0101S
GenePORTER transfection reagent	Genlantis	T201015
Vaccinia Topoisomerase I	Invitrogen	38042-024
Blak-Ray long wave ultraviolet lamp	Upland, CA	B 100 AP	UVA lamp
EpiSonic Multi-Functional Bioprocessor 1100	Epigentek	EQC-1100	Water bath sonicator
Mylar filter	GE Healthcare Life Sciences	80112939
Agarose	Sigma-Aldrich	A6111
BIO-RAD Chemidoc	BIO-RAD	XRS+ system	DNA imaging system
Glycine	Fisher Scientific	BP381-500
37% Formaldehyde	Sigma-Aldrich	F8775-25ML	Used for crosslinking
Proteinase K	New England Biolabs	P8107S
DMEM	ThermoFisher	11965092	Cell culture media
PBS	ThermoFisher	70013073	Cell culture
Trypsin-EDTA	ThermoFisher	25200056	Cell culture
Bromocresol green	Sigma-Aldrich	114-359	DNA loading dye
Siliconized tubes	Fisher Scientific	02-681-320	Low retention microfuge tube
Tris base	Fisher Scientific	BP152-1
Boric Acid	Fisher Scientific	A74-1
EDTA	Fisher Scientific	BP24731
Photometer	InternationalLight Technologies	ILT1400-A	UVA dose measurement
Cell lines
Human U2OS osteosarcoma	ATCC	ATCC HTB-96	Cultured according to supplier’s recommendation
Human cervical adenocarcinoma HeLa	ATCC	ATCC-CCL-2	Cultured according to supplier’s recommendation
Proximal forward primer	5′-gcc ccc ctg acg agc atc ac
Proximal reverse primer	5′-tag tta ccg gat aag gcg cag cgg
Distal forward primer	5′-aat acc gcg cca cat agc ag
Distal reverse primer	5′-agt att caa cat ttc cgt gtc gcc