हेलिक्स विकृत, साइट-विशिष्ट डीएनए Interstrand crosslinks के प्रसंस्करण में वास्तु प्रोटीन HMGB1 की भूमिका का अध्ययन करने के लिए उपकरण
Summary
Targeted DNA damage can be achieved by tethering a DNA damaging agent to a triplex-forming oligonucleotide (TFO). Using modified TFOs, DNA damage-specific protein association, and DNA topology modification can be studied in human cells by the utilization of modified chromatin immunoprecipitation assays and DNA supercoiling assays described herein.
Abstract
उच्च गतिशीलता समूह बॉक्स 1 (HMGB1) प्रोटीन एक गैर हिस्टोन वास्तु प्रोटीन है कि इस तरह के ट्रांसक्रिप्शन, डीएनए प्रतिकृति, और डीएनए की मरम्मत के रूप में जीनोम में कई महत्वपूर्ण कार्य, विनियमन में शामिल किया जाता है। HMGB1 विहित बी-डीएनए के लिए अधिक से अधिक आत्मीयता के साथ संरचनात्मक रूप से विकृत डीएनए को बांधता है। उदाहरण के लिए, हमने पाया HMGB1 बांधता है कि डीएनए interstrand को crosslinks (ICLs), जो covalently डीएनए की दो किस्में लिंक, हेलिक्स की विकृति का कारण है, और अगर छोड़ दिया बिना मरम्मत के सेल मौत का कारण बन सकता है। उनकी साइटोटोक्सिक क्षमता के कारण, कई आईसीएल उत्प्रेरण एजेंटों वर्तमान में क्लिनिक में एजेंटों के रूप में उपयोग किया जाता है। जबकि आईसीएल के गठन एजेंटों निश्चित आधार दृश्यों (जैसे, 5'-टीए-3 'psoralen के लिए पसंदीदा crosslinking साइट है) के लिए वरीयताओं दिखाने के लिए, वे काफी हद तक एक अंधाधुंध फैशन में डीएनए की क्षति प्रेरित। हालांकि, covalently एक Triplex के गठन oligonucleotide (TFO) है, जो एक अनुक्रम विशिष्ट डीएनए को बांधता को आईसीएल उत्प्रेरण एजेंट युग्मन द्वाराढंग से, लक्षित डीएनए की क्षति प्राप्त किया जा सकता है। यहाँ, हम एक TFO covalently, 8-trimethylpsoralen (एचएमटी) psoralen 5 '4'-hydroxymethyl-4,5 करने के लिए अंत' पर संयुग्मित का प्रयोग कर एक उत्परिवर्तन संवाददाता प्लाज्मिड पर एक साइट विशेष आईसीएल उत्पन्न करने के लिए एक उपकरण के रूप में उपयोग करने के लिए मानव कोशिकाओं में HMGB1 द्वारा वास्तु संशोधन, प्रसंस्करण, और जटिल डीएनए घावों की मरम्मत अध्ययन करने के लिए। हम प्रयोगात्मक तकनीक संवाददाता plasmids पर TFO निर्देशित ICLs तैयार करने के लिए, और chromatin immunoprecipitation assays का उपयोग एक सेलुलर संदर्भ में TFO निर्देशित ICLs साथ HMGB1 के सहयोग से पूछताछ करने का वर्णन है। इसके अलावा, हम superhelical HMGB1 द्वारा psoralen-crosslinked प्लाज्मिड पर पेश किया जाता है की राशि को मापने के द्वारा क्षतिग्रस्त डीएनए की विशिष्ट वास्तु संशोधन का आकलन करने के लिए डीएनए सुपर कॉइलिंग assays का वर्णन है। इन तकनीकों में अन्य प्रसंस्करण और TFO निर्देशित ICLs या ब्याज की किसी भी कोशिका लाइन में अन्य लक्षित डीएनए की क्षति की मरम्मत में शामिल प्रोटीन की भूमिका का अध्ययन करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है।
Introduction
एक अनुक्रम विशिष्ट फैशन में Hoogsteen-हाइड्रोजन संबंध के माध्यम से Triplex के गठन ओलईगोन्युक्लियोटाईड्स (TFOs) बाँध द्वैध डीएनए ट्रिपल पेचदार संरचनाओं 1-5 के रूप में। Triplex प्रौद्योगिकी जैसे ट्रांसक्रिप्शन, डीएनए की क्षति की मरम्मत, और जीन को निशाना (संदर्भ 6-8 में समीक्षा) के रूप में biomolecular तंत्र की एक किस्म से पूछताछ करने के लिए इस्तेमाल किया गया है। TFOs संवाददाता plasmids 9,10 पर साइट विशेष क्षति प्रेरित करने के लिए बड़े पैमाने पर इस्तेमाल किया गया है। हमारी प्रयोगशाला और दूसरों को पहले एक psoralen अणु को एक TFO, AG30, सीमित इस्तेमाल किया है प्लाज्मिड pSupFG1 5,10-12 पर supF जीन में साइट विशेष डीएनए interstrand crosslinks (ICLs) प्रेरित करने के लिए। ICLs अत्यधिक साइटोटोक्सिक के रूप में इन घावों covalently दो डीएनए किस्में crosslink हैं, और अगर बिना मरम्मत के लिए छोड़ दिया, जीन प्रतिलेखन ब्लॉक और डीएनए प्रतिकृति मशीनरी 13,14 बाधित कर सकते हैं। उनकी साइटोटोक्सिक क्षमता की वजह से, आईसीएल उत्प्रेरण एजेंटों उपचार में कीमोथेरेपी दवाओं के रूप में इस्तेमाल किया गया हैकैंसर और अन्य बीमारियों में 15। बहरहाल, मानव कोशिकाओं में प्रसंस्करण और ICLs की मरम्मत अच्छी तरह से समझ नहीं है। इस प्रकार, मानव कोशिकाओं में ICLs के प्रसंस्करण में शामिल तंत्र का एक बेहतर समझ आईसीएल आधारित कीमोथेराप्युटिक परहेजों की प्रभावकारिता में सुधार करने में मदद कर सकता है। TFO प्रेरित ICLs और उनकी मरम्मत के मध्यवर्ती डीएनए हेलिक्स के लिए महत्वपूर्ण संरचनात्मक विकृति पैदा करने की क्षमता है। इस तरह की विकृतियों वास्तु प्रोटीन है, जो विहित प्रपत्र बी द्वैध डीएनए 16-20 की तुलना में अधिक आत्मीयता के साथ विकृत डीएनए के लिए बाध्य के लिए संभावित लक्ष्य कर रहे हैं। यहाँ, हम chromatin immunoprecipitation (चिप) psoralen-crosslinked plasmids पर assays के माध्यम से मानव कोशिकाओं में ICLs के साथ एक उच्च प्रचुर मात्रा में प्रोटीन वास्तु की एसोसिएशन, HMGB1 का अध्ययन किया और मानव में psoralen-crosslinked प्लास्मिड डीएनए के टोपोलॉजी नियमन में HMGB1 के लिए एक भूमिका की पहचान कैंसर सेल lysates।
HMGB1 एक अत्यधिक प्रचुर मात्रा में और सर्वत्र व्यक्त की है गैर-अपनेस्वर वास्तु प्रोटीन है कि विहित प्रपत्र बी-डीएनए 17-20 की तुलना में अधिक आत्मीयता के साथ क्षतिग्रस्त डीएनए और वैकल्पिक रूप से संरचित डीएनए substrates को बांधता है। HMGB1 ऐसे ट्रांसक्रिप्शन, डीएनए प्रतिकृति, और डीएनए की मरम्मत 16,21-23 के रूप में कई डीएनए चयापचय की प्रक्रिया में शामिल है। हम पहले से दिखा दिया है कि HMGB1 उच्च आत्मीयता 20 के साथ इन विट्रो में TFO निर्देशित ICLs को बांधता है। इसके अलावा, हम दिखा दिया है कि HMGB1 की कमी एक न्यूक्लियोटाइड छांटना मरम्मत (एनईआर) के सह-कारक के रूप में 23,24 TFO निर्देशित ICLs की mutagenic प्रसंस्करण और पहचान HMGB1 वृद्धि हुई है। हाल ही में, हमने पाया है कि HMGB1 मानव कोशिकाओं में TFO निर्देशित ICLs साथ जुड़ा हुआ है और इस तरह के घावों को इसकी भर्ती एनईआर प्रोटीन, XPA 16 पर निर्भर है। डीएनए के नकारात्मक सुपर कॉइलिंग एनईआर 25 से डीएनए घावों के कुशल हटाने को बढ़ावा देने के लिए दिखाया गया है, और हमने पाया है कि HMGB1 TFO निर्देशित आईसीएल युक्त Plas पर रियायत के तौर पर नकारात्मक सुपर कॉइलिंग लातीमध्य substrates (गैर क्षतिग्रस्त plasmids substrates के सापेक्ष) 16, एक एनईआर सह-कारक के रूप में HMGB1 की संभावित भूमिका (ओं) का एक बेहतर समझ प्रदान करते हैं। ICLs के प्रसंस्करण के लिए पूरी तरह से मानव कोशिकाओं में समझ नहीं है; इस प्रकार, तकनीक और विकसित assays यहाँ बताया आणविक उपकरणों के आधार पर अतिरिक्त आईसीएल की मरम्मत में शामिल प्रोटीन है, जो बारी में के रूप में औषधीय लक्ष्य है कि कैंसर कीमोथेरेपी परहेजों की प्रभावकारिता में सुधार करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता सेवा कर सकते हैं की पहचान करने के लिए ले जा सकता है।
इधर, एक प्रभावी दृष्टिकोण agarose जेल वैद्युतकणसंचलन denaturing चर्चा की गई है द्वारा प्लास्मिड डीएनए में TFO निर्देशित आईसीएल के गठन की क्षमता का आकलन करने के लिए। इसके अलावा, TFO निर्देशित ICLs युक्त plasmids का उपयोग कर, तकनीक आईसीएल क्षतिग्रस्त plasmids के साथ HMGB1 के सहयोग से एक सेलुलर संदर्भ में संशोधित चिप assays का उपयोग निर्धारित करने के लिए वर्णित किया गया है। इसके अतिरिक्त, एक सतही विधि वें द्वारा शुरू की topological संशोधनों का अध्ययन करने के लिएई वास्तु प्रोटीन HMGB1, विशेष रूप से मानव कोशिका lysates में आईसीएल क्षतिग्रस्त प्लाज्मिड substrates पर दो आयामी agarose जेल वैद्युतकणसंचलन के माध्यम से सुपर कॉइलिंग assays के प्रदर्शन के द्वारा निर्धारित किया गया है। तकनीक वर्णित मानव कोशिकाओं में प्लास्मिड पर लक्षित डीएनए की क्षति के प्रसंस्करण में डीएनए की मरम्मत और वास्तु प्रोटीन की भागीदारी की समझ को आगे करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है।
हम प्लास्मिड डीएनए, और बाद में प्लाज्मिड चिप और assays सुपर कॉइलिंग क्रमश प्रोटीन है कि घावों के साथ संबद्ध है, और प्रोटीन है कि डीएनए टोपोलॉजी में परिवर्तन की पहचान है, पर TFO निर्देशित साइट विशेष psoralen ICLs के गठन के लिए विस्तृत प्रोटोकॉल का वर्णन है। ये assays अन्य डीएनए हानिकारक एजेंटों, TFOs, प्लाज्मिड substrates, और ब्याज की स्तनधारी सेल लाइनों के साथ प्रदर्शन करने के लिए संशोधित किया जा सकता है। वास्तव में, हम पता चला है कि वहाँ है कम से कम एक संभावित अद्वितीय और उच्च आत्मीयता TFO बाध्यकारी साइट मानव जीनोम 26 में हर एनोटेट जीन के भीतर। किस तरहकभी, स्पष्टता के लिए, हम इन तकनीकों का एक विशिष्ट psoralen संयुग्मित TFO (pAG30) के इस्तेमाल के लिए मानव U2OS कोशिकाओं में एक विशिष्ट उत्परिवर्तन संवाददाता प्लाज्मिड (pSupFG1) पर वर्णित के रूप में हम मुखर्जी और Vasquez, 2016 16 में उपयोग किया है।
Protocol
Representative Results
Discussion
(अपने लक्ष्य के लिए TFO के बंधन आत्मीयता पर निर्भर अपने लक्ष्य डीएनए सब्सट्रेट के साथ TFO की ऊष्मायन के पहले, उचित बफर घटक (जैसे, MgCl 2) और समय: TFO निर्देशित ICLs के कुशल गठन के दो महत्वपूर्ण कारकों पर निर्भर ?…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
लेखकों उपयोगी विचार विमर्श के लिए Vasquez प्रयोगशाला के सदस्यों को धन्यवाद देना चाहूंगा। इस काम के स्वास्थ्य / राष्ट्रीय कैंसर संस्थान के राष्ट्रीय संस्थान द्वारा समर्थित किया गया था [CA097175, CA093279 Kmv करने के लिए]; और कैंसर की रोकथाम और टेक्सास के रिसर्च इंस्टीट्यूट [RP101501]। ओपन एक्सेस चार्ज करने के लिए अनुदान: स्वास्थ्य / के राष्ट्रीय संस्थानों राष्ट्रीय कैंसर संस्थान [KMV को CA093279]।
Materials
| 5'HMT Psoralen-AG30 | Midland Certified Reagent Co., Midland, TX | Custom order | HPLC (or gel) purified |
| Simple ChIP Enzymatic Chromatin IP Kit | Cell signaling Inc. | 9003 | Manufacturer suggested protocol is optimized for chromatin IP and not for plasmid IP. The control IgG and H3 antibodies as well as the Protein G beads and micrococcal nuclease are supplied by the manufacturer. |
| GoTaq Green | Promega | M7122 | PCR master mix |
| HMGB1 antibody | Abcam | Ab18256 | |
| Wizard Gel and PCR cleanup kit | Promega | A9281 | |
| Chloroquine-diphosphate salt | Sigma | C6628-50G | For two-dimensional agarose gel electrophoresis |
| EcoRI | New England BioLabs | R0101S | |
| GenePORTER transfection reagent | Genlantis | T201015 | |
| Vaccinia Topoisomerase I | Invitrogen | 38042-024 | |
| Blak-Ray long wave ultraviolet lamp | Upland, CA | B 100 AP | UVA lamp |
| EpiSonic Multi-Functional Bioprocessor 1100 | Epigentek | EQC-1100 | Water bath sonicator |
| Mylar filter | GE Healthcare Life Sciences | 80112939 | |
| Agarose | Sigma-Aldrich | A6111 | |
| BIO-RAD Chemidoc | BIO-RAD | XRS+ system | DNA imaging system |
| Glycine | Fisher Scientific | BP381-500 | |
| 37% Formaldehyde | Sigma-Aldrich | F8775-25ML | Used for crosslinking |
| Proteinase K | New England Biolabs | P8107S | |
| DMEM | ThermoFisher | 11965092 | Cell culture media |
| PBS | ThermoFisher | 70013073 | Cell culture |
| Trypsin-EDTA | ThermoFisher | 25200056 | Cell culture |
| Bromocresol green | Sigma-Aldrich | 114-359 | DNA loading dye |
| Siliconized tubes | Fisher Scientific | 02-681-320 | Low retention microfuge tube |
| Tris base | Fisher Scientific | BP152-1 | |
| Boric Acid | Fisher Scientific | A74-1 | |
| EDTA | Fisher Scientific | BP24731 | |
| Photometer | InternationalLight Technologies | ILT1400-A | UVA dose measurement |
| Cell lines | |||
| Human U2OS osteosarcoma | ATCC | ATCC HTB-96 | Cultured according to supplier’s recommendation |
| Human cervical adenocarcinoma HeLa | ATCC | ATCC-CCL-2 | Cultured according to supplier’s recommendation |
| Proximal forward primer | 5′-gcc ccc ctg acg agc atc ac | ||
| Proximal reverse primer | 5′-tag tta ccg gat aag gcg cag cgg | ||
| Distal forward primer | 5′-aat acc gcg cca cat agc ag | ||
| Distal reverse primer | 5′-agt att caa cat ttc cgt gtc gcc |
Referências
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