Ferramentas para estudar o papel da HMGB1 Protein Architectural no processamento de Helix distorcendo, DNA Site-specific intercadeias Crosslinks

Summary

Targeted DNA damage can be achieved by tethering a DNA damaging agent to a triplex-forming oligonucleotide (TFO). Using modified TFOs, DNA damage-specific protein association, and DNA topology modification can be studied in human cells by the utilization of modified chromatin immunoprecipitation assays and DNA supercoiling assays described herein.

Abstract

caixa de grupo de alta mobilidade 1 (HMGB1) a proteína é uma proteína não-histona arquitectónico que está envolvido na regulação de muitas funções importantes no genoma, tais como transcrição, replicação de ADN, e a reparação do ADN. HMGB1 se liga ao DNA estruturalmente distorcida com maior afinidade do que a B-ADN canónica. Por exemplo, descobrimos que HMGB1 se liga ao DNA intercadeias ligações cruzadas (CIET), que covalentemente ligam as duas cadeias do DNA, causar distorção da hélice e, se deixada sem conserto pode causar morte celular. Devido ao seu potencial citotóxico, vários agentes indutores de ICL são actualmente utilizados como agentes quimioterapêuticos em clínica. Enquanto os agentes ICL-formando mostrar preferências por certas sequências de bases (por exemplo, 5'-TA-3 'é o local de reticulação preferido para psoraleno), que em grande parte induz danos no ADN de uma forma indiscriminada. No entanto, por acoplamento covalente do agente de indução de ICL a um oligonucleótido de formação de triplex (TFO), que se liga a DNA de uma sequência-específicaforma, o dano ao DNA alvo pode ser alcançado. Aqui, nós utilizamos um TFO covalentemente conjugado no "fim a um 4'-hidroximetil-4,5 'a 5 (HMT) psoraleno, 8-trimetilpsoraleno para gerar um ICL específica do local num plasmídeo repórter-mutação a ser usado como uma ferramenta para estudar a modificação de arquitectura, processamento, e reparação das lesões do ADN complexas por HMGB1 em células humanas. Descrevemos técnicas experimentais para preparar ICLs TFO dirigidos em plasmídeos repórter, e para interrogar a associação de HMGB1 com os ICLs TFO dirigidos em um contexto celular usando ensaios cromatina imunoprecipitação. Além disso, descreve-se ensaios de super-enrolamento de ADN para avaliar a alteração de arquitectura específica do ADN danificado por medição da quantidade de voltas superhelical introduzidas no plasmídeo psoraleno-reticulada por HMGB1. Estas técnicas podem ser usadas para estudar os papéis de outras proteínas envolvidas no processamento e reparação de ICLs TFO-dirigida ou outro dano do DNA alvo em qualquer linha celular de interesse.

Introduction

Triplex-formando oligonucleotídeos (TFO) DNA ligam duplex de uma forma específica de sequência por meio de ligação de Hoogsteen-hidrogênio para formar estruturas ^1-5 triple-helicoidais. Tecnologia triplex foi utilizado para interrogar uma variedade de mecanismos biomoleculares, tais como a transcrição, reparação de danos do ADN, e o gene de segmentação (revisto em referências ^6-8). TFO têm sido amplamente utilizados para induzir dano local específico em plasmídeos repórter ^9,10. O nosso laboratório e outros já anteriormente utilizado um TFO, AG30, presa a uma molécula de psoraleno para induzir reticulações intercadeias de ADN específicas do local (ICLs) no gene supF no plasmídeo pSupFG1 ^5,10-12. ICLs são altamente citotóxica como estas lesões covalente reticular as duas cadeias de ADN e, se deixada sem conserto, pode bloquear a transcrição de genes e impedem a maquinaria de replicação do DNA ^13,14. Devido ao seu potencial citotóxico, agentes indutores de ICL foram usados ​​como drogas quimioterapêuticas no tratamentode câncer e outras doenças ^15. No entanto, o processamento e reparação de ICLs nas células humanas não é bem compreendido. Assim, uma melhor compreensão dos mecanismos envolvidos no processamento de ICLs em células humanas pode ajudar a melhorar a eficácia dos regimes quimioterapêuticos baseados em ICL. ICLs-induzidas TFO e seus intermediários reparação têm o potencial de causar distorções estruturais importantes para a hélice do ADN. Tais distorções são alvos prováveis para proteínas de arquitectura, que se ligam ao ADN distorcido com maior afinidade do que a B-forma canónica de ADN duplex ^16-20. Aqui, estudou-se a associação de uma proteína de arquitectura altamente abundante, HMGB1 com ICLs em células humanas por meio de imunoprecipitação da cromatina (ChIP) ensaios em plasmídeos de psoraleno-reticulado e identificado um papel para HMGB1 na modulação da topologia do ADN plasmídeo psoraleno-reticulado em humanos Os lisados ​​celulares de cancro.

HMGB1 é altamente abundante e ubiquamente expresso não-Hisproteína arquitectónico tom que se liga ao DNA danificado e substratos de DNA, alternativamente, estruturados com maior afinidade do que o DNA-forma canónica B ^17-20. HMGB1 está envolvido em vários processos metabólicos de ADN, tais como a transcrição, replicação de ADN, e a reparação do ADN ^16,21-23. Demonstrámos previamente que se liga a HMGB1 ICLs TFO-dirigida in vitro com alta afinidade ^20. Além disso, demonstrámos que a falta de HMGB1 aumentou o processamento mutagénico de ICLs TFO-HMGB1 dirigidos e identificado como uma reparação de excisão de nucleótidos (ILM) de co-factor de ^23,24. Recentemente, verificou-se que está associado com HMGB1 ICLs TFO-dirigidas em células humanas e o seu recrutamento de tais lesões é dependente da proteína NER, XPA ^16. Superenrolamento negativo do ADN tem mostrado promover a remoção eficiente das lesões do ADN por NER ^25, e verificou-se que a HMGB1 induz superenrolamento negativo preferencialmente em TFO dirigidos Plas-ICL contendomeados substratos (em relação a substratos não danificado, plasmídeos) ^16, proporcionando uma melhor compreensão do papel potencial (s) de HMGB1 como um co-factor NER. O processamento de ICLs não é totalmente compreendido, em células humanas; Assim, as técnicas e ensaios desenvolvidos com base em ferramentas moleculares aqui descritos podem levar à identificação de proteínas adicionais envolvidos na reparação de ICL, que por sua vez podem servir como alvos farmacológicos que podem ser exploradas para melhorar a eficácia dos regimes de quimioterapia do cancro.

Aqui, uma abordagem eficaz para avaliar a eficiência de formação de TFO-dirigida ICL em DNA de plasmídeo por electroforese em gel desnaturante de agarose foi discutido. Além disso, utilizando os plasmídeos que contêm os ICLs TFO-dirigidas, técnicas para determinar a associação de HMGB1 com os plasmídeos de ICL-danificados num contexto celular utilizando ensaios ChIP modificados foram descritos. Além disso, um método fácil para estudar as modificações introduzidas por Th topológicose HMGB1 proteína de arquitectura, especificamente sobre substratos plasmídeo ICL-danificadas em lisados ​​de células humanas foi determinada realizando ensaios de super-enrolamento através de electroforese em gel de agarose bidimensional. As técnicas descritas podem ser usadas para ajudar a compreender o envolvimento da reparação do ADN e proteínas de arquitectura no tratamento de danos no ADN alvo em plasmídeos em células humanas.

Descrevemos protocolos pormenorizados para a formação de ICLs psoraleno específicas do local dirigidas no TFO-DNA do plasmídeo e subsequente ChIP plasmídeo super-enrolamento e ensaios para identificar proteínas que se associam com as lesões, e proteínas que alteram a topologia do ADN, respectivamente. Estes ensaios podem ser modificados para realizar com outros agentes prejudiciais de ADN, TFO, substratos de plasmídeos, e as linhas de células de mamífero de interesse. Na verdade, temos mostrado que há pelo menos um potencial de afinidade única e alta local TFO de ligação dentro de cada gene anotada no genoma humano ^26. Comocada vez, para maior clareza, que estas técnicas descritas para a utilização específica de um TFO psoraleno-conjugado (pAG30) num plasmídeo repórter-mutação específica (pSupFG1) em células humanas U2OS que temos utilizado em Mukherjee & Vasquez, 2016 ^16.

Protocol

1. Preparação de ICLs TFO-dirigidas no plasmídeo Substratos Incubar quantidades equimolares de pSupFG1 10,11 plasmídeo de DNA (DNA de plasmídeo de 5 ug é um bom ponto de partida) com psoraleno-AG30 conjugado TFO em 8 mL de tampão de ligação triplex [50% de glicerol, Tris 10 mM (pH 7,6), 10 mM de MgCl 2] e dH 2 o para um volume final de 40 ul num tubo de âmbar. Misture bem, pipetando para cima e para baixo. Incubar a reacção a 37 ° C banho de água durante 12 h. </…

Representative Results

Formação do ICL TFO-dirigida é crítico para os ensaios de plasmídeo baseado, que são utilizados para interrogar as funções das proteínas de arquitectura do processamento de ICL, em células humanas. Electroforese em gel desnaturante de agarose é uma maneira fácil para determinar a eficiência da formação de ICL TFO-dirigida. Os plasmídeos que albergam ICLs TFO dirigidos migram com uma mobilidade mais lenta através da matriz de gel de agarose (Figura 1A, pi…

Discussion

A formação eficiente de ICLs TFO-dirigida é dependente de dois factores fundamentais: Em primeiro lugar, os componentes do tampão adequado (por exemplo, MgCl ₂₎ e o tempo de incubação do TFO com o seu substrato de ADN alvo (dependente da afinidade de ligação do TFO ao seu alvo duplex, e as concentrações utilizadas); e segundo, a irradiação a dose apropriada de radiação UVA (365 nm) para formar reticulações de psoraleno eficientemente. formação de triplex ideal pode ser conseguido at…

Materials

5'HMT Psoralen-AG30	Midland Certified Reagent Co., Midland, TX	Custom order	HPLC (or gel) purified
Simple ChIP Enzymatic Chromatin IP Kit	Cell signaling Inc.	9003	Manufacturer suggested protocol is optimized for chromatin IP and not for plasmid IP. The control IgG and H3 antibodies as well as the Protein G beads and micrococcal nuclease are supplied by the manufacturer.
GoTaq Green	Promega	M7122	PCR master mix
HMGB1 antibody	Abcam	Ab18256
Wizard Gel and PCR cleanup kit	Promega	A9281
Chloroquine-diphosphate salt	Sigma	C6628-50G	For two-dimensional agarose gel electrophoresis
EcoRI	New England BioLabs	R0101S
GenePORTER transfection reagent	Genlantis	T201015
Vaccinia Topoisomerase I	Invitrogen	38042-024
Blak-Ray long wave ultraviolet lamp	Upland, CA	B 100 AP	UVA lamp
EpiSonic Multi-Functional Bioprocessor 1100	Epigentek	EQC-1100	Water bath sonicator
Mylar filter	GE Healthcare Life Sciences	80112939
Agarose	Sigma-Aldrich	A6111
BIO-RAD Chemidoc	BIO-RAD	XRS+ system	DNA imaging system
Glycine	Fisher Scientific	BP381-500
37% Formaldehyde	Sigma-Aldrich	F8775-25ML	Used for crosslinking
Proteinase K	New England Biolabs	P8107S
DMEM	ThermoFisher	11965092	Cell culture media
PBS	ThermoFisher	70013073	Cell culture
Trypsin-EDTA	ThermoFisher	25200056	Cell culture
Bromocresol green	Sigma-Aldrich	114-359	DNA loading dye
Siliconized tubes	Fisher Scientific	02-681-320	Low retention microfuge tube
Tris base	Fisher Scientific	BP152-1
Boric Acid	Fisher Scientific	A74-1
EDTA	Fisher Scientific	BP24731
Photometer	InternationalLight Technologies	ILT1400-A	UVA dose measurement
Cell lines
Human U2OS osteosarcoma	ATCC	ATCC HTB-96	Cultured according to supplier’s recommendation
Human cervical adenocarcinoma HeLa	ATCC	ATCC-CCL-2	Cultured according to supplier’s recommendation
Proximal forward primer	5′-gcc ccc ctg acg agc atc ac
Proximal reverse primer	5′-tag tta ccg gat aag gcg cag cgg
Distal forward primer	5′-aat acc gcg cca cat agc ag
Distal reverse primer	5′-agt att caa cat ttc cgt gtc gcc