Verktyg för att studera betydelsen av Architectural Protein HMGB1 i behandlingen av Helix snedvrida, Platsspecifik DNA Interstrand tvärbindningar
Summary
Targeted DNA damage can be achieved by tethering a DNA damaging agent to a triplex-forming oligonucleotide (TFO). Using modified TFOs, DNA damage-specific protein association, and DNA topology modification can be studied in human cells by the utilization of modified chromatin immunoprecipitation assays and DNA supercoiling assays described herein.
Abstract
Hög rörlighet grupprutan 1 (HMGB1) proteinet är en icke-histon arkitektoniska protein som är involverat i regleringen av många viktiga funktioner i genomet, såsom transkription, DNA-replikation och DNA-reparation. HMGB1 binder till strukturellt förvrängd DNA med högre affinitet än till kanoniska B-DNA. Till exempel, fann vi att HMGB1 binder till DNA interstrand tvärbindningar (ICLs), som kovalent länkar de två delarna av DNA vålla snedvridning av spiralen, och om de lämnas oreparerade kan orsaka celldöd. På grund av deras cytotoxiska potential, finns flera ICL-inducerande medel som för närvarande används som kemoterapeutiska medel i kliniken. Medan ICL-bildande medel visar preferenser för vissa bassekvenser (t.ex. 5'-TA-3 'är den föredragna tvärbindningsställe för psoralen), de i hög grad inducerar DNA-skada i en urskillningslös sätt. Men genom att kovalent koppla ICL-inducerande medel till en triplex-bildande oligonukleotid (TFO), som binder till DNA i ett sekvensspecifiktsätt, kan uppnås målinriktad DNA-skada. Här använder vi en TFO kovalent konjugerat på 5 'änden till en 4'-hydroximetyl-4,5', 8-trimetylpsoralen (HMT) psoralen för att generera en platsspecifik ICL på en mutation-reporterplasmid för att använda som ett verktyg att studera arkitektoniska modifiering, bearbetning, och reparation av komplexa DNA-skador av HMGB1 i humana celler. Vi beskriver experimentella tekniker för att förbereda TFO riktade ICLs på reporter plasmider och förhöra den sammanslutning av HMGB1 med TFO riktade ICLs i ett cellulärt sammanhang med hjälp av kromatin immunoprecipitation analyser. Dessutom beskriver vi DNA supercoiling analyser för att bedöma specifika arkitektoniska modifiering av den skadade DNA genom mätning av mängden superhelixvarv introduceras på psoralen-tvärbunden plasmid genom HMGB1. Dessa tekniker kan användas för att studera rollerna av andra proteiner involverade i bearbetning och reparation av TFO-riktade ICLs eller andra riktade DNA-skada i någon cellinje av intresse.
Introduction
Triplex-bildande oligonukleotider (TFOs) binder duplex-DNA på ett sekvensspecifikt sätt via Hoogsteen-vätebindning för att bilda trippelspiralstrukturer 1-5. Triplex teknik har använts för att förhöra en mängd biomolekylära mekanismer, såsom transkription, DNA-skador reparation och genmålsökning (granskas i referenserna 6-8). TFOs har använts i stor utsträckning för att framkalla platsspecifika skador på reporterplasmider 9,10. Vårt laboratorium och andra har tidigare använt en TFO, VT30, bundna till en psoralen molekyl för att framkalla platsspecifika DNA interstrand tvärbindningar (ICLs) i supF-genen på plasmiden pSupFG1 5,10-12. ICLs är mycket cytotoxiska eftersom dessa skador kovalent tvärbinda de två DNA-strängarna, och om de lämnas utan reparation, kan blockera gentranskription och hindra DNA-replikation maskiner 13,14. På grund av deras cytotoxiska potential har ICL-inducerande medel använts som kemoterapeutiska läkemedel för behandlingav cancer och andra sjukdomar 15. Emellertid är bearbetning och reparation av ICLs i humana celler inte väl förstådd. Således kan en bättre förståelse av de mekanismer som är involverade i behandlingen av ICLs i humana celler bidra till att förbättra effektiviteten hos ICL-baserade kemoterapeutiska regimer. TFO-inducerade ICLs och deras reparationsmellan har potential att orsaka betydande strukturella snedvridning av DNA-spiralen. Sådan snedvridning är troliga mål för arkitektoniska proteiner, som binder till snedvriden DNA med högre affinitet än till kanonisk B-formen duplex-DNA 16-20. Här studerade vi föreningen av en mycket riklig arkitektonisk protein, HMGB1 med ICLs i humana celler via kromatin immunoprecipitation (chip) analyser om psoralen-tvärbundna plasmider och identifierade en roll för HMGB1 vid modulering av topologin av psoralen-tvärbunden plasmid-DNA i human cancer cellysat.
HMGB1 är en mycket riklig och allmänt utbrett uttryckt icke-hanstonen arkitektoniska protein som binder till skadat DNA och alternativt strukturerade DNA-substrat med högre affinitet än kanonisk B-form av DNA 17-20. HMGB1 är involverat i flera DNA metaboliska processer, såsom transkription, DNA-replikation och DNA-reparation 16,21-23. Vi har tidigare visat att HMGB1 binder till TFO-riktade ICLs in vitro med hög affinitet 20. Vidare har vi visat att bristen på HMGB1 ökade mutagen behandling av TFO-riktade ICLs och identifierade HMGB1 som en nukleotid excision reparation (NER) kofaktor 23,24. Nyligen har vi funnit att HMGB1 är associerad med TFO-riktade ICLs i humana celler och dess rekrytering till sådana lesioner är beroende av NER-proteinet, XPA 16. Negativ supercoiling av DNA har visat att främja en effektiv borttagning av DNA-skador genom NER 25, och vi har funnit att HMGB1 inducerar negativ supercoiling företrädesvis på TFO-riktade ICL-innehållande plasmitten substrat (i förhållande till icke-skadade plasmider substrat) 16, vilket ger en bättre förståelse av den potentiella roll (er) av HMGB1 som en NER co-faktor. Bearbetningen av ICLs är inte helt förstådd i humana celler; således kunde tekniker och analyser utvecklats baserat på de molekylära verktyg som beskrivs här leda till identifiering av ytterligare proteiner involverade i ICL reparation, vilket i sin tur kan tjäna som farmakologiska mål som kan utnyttjas för att förbättra effektiviteten av cancer kemoterapi.
Här, för att en effektiv strategi bedöma effektiviteten av TFO-riktad ICL-bildning i plasmid-DNA genom denaturerande agarosgelelektrofores har diskuterats. Vidare, med användning av de plasmider som innehåller de TFO-riktade ICLs, tekniker för att bestämma associationen av HMGB1 med ICL-skadade plasmider i ett cellulärt sammanhang användning av modifierade ChIP-analyser har beskrivits. Dessutom, till en enkel metod att studera topologiska ändringar som infördes av the arkitektoniska protein HMGB1, särskilt på ICL-skadade plasmid substrat i humana cellysat har bestämts genom att utföra supercoiling analyser via tvådimensionell agarosgelelektrofores. De tekniker som beskrivs kan användas för att öka förståelsen av inblandningen av DNA-reparation och arkitektoniska proteiner vid bearbetning av målinriktad DNA-skada på plasmider i humana celler.
Vi beskriver detaljerade protokoll för bildandet av TFO-riktade platsspecifika psoralen ICLs på plasmid-DNA, och efterföljande plasmid ChIP och supercoiling analyser för att identifiera proteiner som associerar med de lesioner, och proteiner som förändrar DNA-topologi, respektive. Dessa analyser kan modifieras för att utföra med andra DNA-skadande medel, TFOs, plasmid substrat och däggdjurscellinjer av intresse. I själva verket har vi visat att det finns åtminstone ett potentiellt unik och hög affinitet TFO-bindningsställe inom varje kommenterad genen i det humana genomet 26. Hurnågonsin, för tydlighetens skull, beskrev vi dessa tekniker för användning av ett visst psoralen-konjugerat TFO (pAG30) på en specifik mutation-reporterplasmid (pSupFG1) i humana U2OS celler som vi har använt i Mukherjee & Vasquez, 2016 16.
Protocol
Representative Results
Discussion
Den effektiva bildningen av TFO-riktade ICLs är beroende av två viktiga faktorer: För det första, korrekt buffertkomponenter (t.ex. MgCl2) och tid för inkubation av TFO med dess mål-DNA-substrat (beroende på bindningsaffiniteten hos TFO till sitt mål duplex, och koncentrationerna som används); och andra, den rätta dosen av UVA (365 nm) bestrålning för att bilda psoralen tvärbindningar effektivt. Optimal triplexbildning kan uppnås genom användning av HPLC eller gel renade TFOs. Föroren…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Författarna vill tacka medlemmarna i Vasquez laboratorium för bra diskussioner. Detta arbete stöddes av National Institutes of Health / National Cancer Institute [CA097175, CA093279 att KMV]; och förebyggande av cancer och Forskningsinstitut Texas [RP101501]. Finansiering för open access laddning: National Institutes of Health / National Cancer Institute [CA093279 till KMV].
Materials
| 5'HMT Psoralen-AG30 | Midland Certified Reagent Co., Midland, TX | Custom order | HPLC (or gel) purified |
| Simple ChIP Enzymatic Chromatin IP Kit | Cell signaling Inc. | 9003 | Manufacturer suggested protocol is optimized for chromatin IP and not for plasmid IP. The control IgG and H3 antibodies as well as the Protein G beads and micrococcal nuclease are supplied by the manufacturer. |
| GoTaq Green | Promega | M7122 | PCR master mix |
| HMGB1 antibody | Abcam | Ab18256 | |
| Wizard Gel and PCR cleanup kit | Promega | A9281 | |
| Chloroquine-diphosphate salt | Sigma | C6628-50G | For two-dimensional agarose gel electrophoresis |
| EcoRI | New England BioLabs | R0101S | |
| GenePORTER transfection reagent | Genlantis | T201015 | |
| Vaccinia Topoisomerase I | Invitrogen | 38042-024 | |
| Blak-Ray long wave ultraviolet lamp | Upland, CA | B 100 AP | UVA lamp |
| EpiSonic Multi-Functional Bioprocessor 1100 | Epigentek | EQC-1100 | Water bath sonicator |
| Mylar filter | GE Healthcare Life Sciences | 80112939 | |
| Agarose | Sigma-Aldrich | A6111 | |
| BIO-RAD Chemidoc | BIO-RAD | XRS+ system | DNA imaging system |
| Glycine | Fisher Scientific | BP381-500 | |
| 37% Formaldehyde | Sigma-Aldrich | F8775-25ML | Used for crosslinking |
| Proteinase K | New England Biolabs | P8107S | |
| DMEM | ThermoFisher | 11965092 | Cell culture media |
| PBS | ThermoFisher | 70013073 | Cell culture |
| Trypsin-EDTA | ThermoFisher | 25200056 | Cell culture |
| Bromocresol green | Sigma-Aldrich | 114-359 | DNA loading dye |
| Siliconized tubes | Fisher Scientific | 02-681-320 | Low retention microfuge tube |
| Tris base | Fisher Scientific | BP152-1 | |
| Boric Acid | Fisher Scientific | A74-1 | |
| EDTA | Fisher Scientific | BP24731 | |
| Photometer | InternationalLight Technologies | ILT1400-A | UVA dose measurement |
| Cell lines | |||
| Human U2OS osteosarcoma | ATCC | ATCC HTB-96 | Cultured according to supplier’s recommendation |
| Human cervical adenocarcinoma HeLa | ATCC | ATCC-CCL-2 | Cultured according to supplier’s recommendation |
| Proximal forward primer | 5′-gcc ccc ctg acg agc atc ac | ||
| Proximal reverse primer | 5′-tag tta ccg gat aag gcg cag cgg | ||
| Distal forward primer | 5′-aat acc gcg cca cat agc ag | ||
| Distal reverse primer | 5′-agt att caa cat ttc cgt gtc gcc |
Referências
- Moser, H. E., Dervan, P. B. Sequence-specific cleavage of double helical DNA by triple helix formation. Science. 238, 645-650 (1987).
- Cooney, M., Czernuszewicz, G., Postel, E. H., Flint, S. J., Hogan, M. E. Site-specific oligonucleotide binding represses transcription of the human c-myc gene in vitro. Science. 241, 456-459 (1988).
- Beal, P. A., Dervan, P. B. Second structural motif for recognition of DNA by oligonucleotide-directed triple-helix formation. Science. 251, 1360-1363 (1991).
- Vasquez, K. M., Dagle, J. M., Weeks, D. L., Glazer, P. M. Chromosome targeting at short polypurine sites by cationic triplex-forming oligonucleotides. J Biol Chem. 276, 38536-38541 (2001).
- Vasquez, K. M., Christensen, J., Li, L., Finch, R. A., Glazer, P. M. Human XPA and RPA DNA repair proteins participate in specific recognition of triplex-induced helical distortions. Proc Natl Acad Sci U S A. 99, 5848-5853 (2002).
- Mukherjee, A., Vasquez, K. M. Triplex technology in studies of DNA damage, DNA repair, and mutagenesis. Biochimie. 93, 1197-1208 (2011).
- Chin, J. Y., Glazer, P. M. Repair of DNA lesions associated with triplex-forming oligonucleotides. Mol Carcinog. 48, 389-399 (2009).
- Seidman, M. M., Glazer, P. M. The potential for gene repair via triple helix formation. J Clin Invest. 112, 487-494 (2003).
- Vasquez, K. M. Targeting and processing of site-specific DNA interstrand crosslinks. Environ Mol Mutagen. 51, 527-539 (2010).
- Wang, G., Levy, D. D., Seidman, M. M., Glazer, P. M. Targeted mutagenesis in mammalian cells mediated by intracellular triple helix formation. Mol Cell Biol. 15, 1759-1768 (1995).
- Wang, G., Seidman, M. M., Glazer, P. M. Mutagenesis in mammalian cells induced by triple helix formation and transcription-coupled repair. Science. 271, 802-805 (1996).
- Chen, Z., Xu, X. S., Yang, J., Wang, G. Defining the function of XPC protein in psoralen and cisplatin-mediated DNA repair and mutagenesis. Carcinogenesis. 24, 1111-1121 (2003).
- Derheimer, F. A., Hicks, J. K., Paulsen, M. T., Canman, C. E., Ljungman, M. Psoralen-induced DNA interstrand cross-links block transcription and induce p53 in an ataxia-telangiectasia and rad3-related-dependent manner. Mol Pharmacol. 75, 599-607 (2009).
- Vare, D., et al. DNA interstrand crosslinks induce a potent replication block followed by formation and repair of double strand breaks in intact mammalian cells. DNA repair. 11, 976-985 (2012).
- Huang, Y., Li, L. DNA crosslinking damage and cancer – a tale of friend and foe. Transl Cancer Res. 2, 144-154 (2013).
- Mukherjee, A., Vasquez, K. M. HMGB1 interacts with XPA to facilitate the processing of DNA interstrand crosslinks in human cells. Nucleic Acids Res. 44, 1151-1160 (2016).
- Bidney, D. L., Reeck, G. R. Purification from cultured hepatoma cells of two nonhistone chromatin proteins with preferential affinity for single-stranded DNA: apparent analogy with calf thymus HMG proteins. Biochem Biophys Res Commun. 85, 1211-1218 (1978).
- Bianchi, M. E., Beltrame, M., Paonessa, G. Specific recognition of cruciform DNA by nuclear protein HMG1. Science. 243, 1056-1059 (1989).
- Jung, Y., Lippard, S. J. Nature of full-length HMGB1 binding to cisplatin-modified DNA. Bioquímica. 42, 2664-2671 (2003).
- Reddy, M. C., Christensen, J., Vasquez, K. M. Interplay between human high mobility group protein 1 and replication protein A on psoralen-cross-linked DNA. Bioquímica. 44, 4188-4195 (2005).
- Das, D., Scovell, W. M. The binding interaction of HMG-1 with the TATA-binding protein/TATA complex. J Biol Chem. 276, 32597-32605 (2001).
- Little, A. J., Corbett, E., Ortega, F., Schatz, D. G. Cooperative recruitment of HMGB1 during V(D)J recombination through interactions with RAG1 and DNA. Nucleic Acids Res. 41, 3289-3301 (2013).
- Lange, S. S., Mitchell, D. L., Vasquez, K. M. High mobility group protein B1 enhances DNA repair and chromatin modification after DNA damage. Proc Natl Acad Sci U S A. 105, 10320-10325 (2008).
- Lange, S. S., Reddy, M. C., Vasquez, K. M. Human HMGB1 directly facilitates interactions between nucleotide excision repair proteins on triplex-directed psoralen interstrand crosslinks. DNA repair. 8, 865-872 (2009).
- Park, J. Y., Ahn, B. Effect of DNA topology on plasmid DNA repair in vivo. FEBS letters. , 174-178 (2000).
- Wu, Q., et al. High-affinity triplex-forming oligonucleotide target sequences in mammalian genomes. Mol Carcinog. 46, 15-23 (2007).
- Sheflin, L. G., Spaulding, S. W. High mobility group protein 1 preferentially conserves torsion in negatively supercoiled DNA. Bioquímica. 28, 5658-5664 (1989).
- Betous, R., et al. Role of TLS DNA polymerases eta and kappa in processing naturally occurring structured DNA in human cells. Mol Carcinog. 48, 369-378 (2009).
- Luo, Z., Macris, M. A., Faruqi, A. F., Glazer, P. M. High-frequency intrachromosomal gene conversion induced by triplex-forming oligonucleotides microinjected into mouse cells. Proc Natl Acad Sci U S A. 97, 9003-9008 (2000).
- Vasquez, K. M., Wang, G., Havre, P. A., Glazer, P. M. Chromosomal mutations induced by triplex-forming oligonucleotides in mammalian cells. Nucleic Acids Res. 27, 1176-1181 (1999).
- Puri, N., et al. Minimum number of 2′-O-(2-aminoethyl) residues required for gene knockout activity by triple helix forming oligonucleotides. Bioquímica. 41, 7716-7724 (2002).
- Christensen, L. A., Finch, R. A., Booker, A. J., Vasquez, K. M. Targeting oncogenes to improve breast cancer chemotherapy. Cancer Res. 66, 4089-4094 (2006).
- Boulware, S. B., et al. Triplex-forming oligonucleotides targeting c-MYC potentiate the anti-tumor activity of gemcitabine in a mouse model of human cancer. Mol Carcinog. 53, 744-752 (2014).
