Simple methods to detect the selective activation of G proteins by G protein-coupled receptors remain an outstanding challenge in cell signaling. Here, Fӧrster resonance energy transfer (FRET) biosensors have been developed by pairwise tethering a GPCR to G protein peptides to probe conformational changes at controlled concentrations in live cells.
Fӧrster resonans energi overføring (FRET) -baserte studier har blitt stadig mer vanlig i etterforskningen av GPCR signalering. Vår forskningsgruppe utviklet en intra-molekylær FRET sensor for å oppdage samspillet mellom Gα underenheter og GPCRs i levende celler følgende agonist stimulering. Her har vi detalj protokollen for å detektere endringer i FRET mellom β 2-adrenerge reseptoren og Gas C-terminale peptid ved behandling med 100 uM isoproterenol-hydroklorid som tidligere karakteriserte 1. Vår FRET sensor er et enkelt polypeptid bestående serie av en full-lengde GPCR, en FRET akseptor fluorofor (mCitrine), en ER / K krampe (systematisk protein affinitet styrke modulasjon) linker, en FRET donor fluorofor (mCerulean), og en Gα C terminale peptid. Denne protokollen vil detalj celle forberedelse, transfeksjon forhold, oppsett av utstyr, analyse gjennomføring og dataanalyse. Dette eksperimentell design oppdager små lmanges i FRET indikasjon på protein-protein interaksjoner, og kan også brukes til å sammenligne styrken av interaksjonen tvers av ligander og GPCR-G-protein paringer. For å forbedre signal-til-støy i våre målinger, krever denne protokollen økt presisjon i alle ledd, og er presentert her for å muliggjøre reproduserbar utførelse.
G-protein-koblede reseptorer (GPCR) er syv-transmembran-reseptorer. Det humane genom alene inneholder omtrent 800 gener som koder for GPCR, som aktiveres av en rekke ligander, inkludert lys, odoranter, hormoner, peptider, medikamenter og andre små molekyler. Nesten 30% av alle legemidler på markedet målet GPCRs fordi de spiller en stor rolle i mange sykdomstilstander 2. Til tross for flere tiår med omfattende arbeidet som er gjort på denne reseptoren familie, er det fortsatt betydelige utestående spørsmål i feltet, spesielt med hensyn til de molekylære mekanismene som driver GPCR-effektor interaksjoner. Hittil har bare en høy oppløsning krystallstruktur blitt publisert, og gir innsikt i samspillet mellom β 2-adrenerge reseptor (β 2-AR) og Gs protein tre. Sammen med omfattende forskning i de siste tre tiårene, gjentar det en bestemt strukturell komponent som er avgjørende i denneinteraksjon: den Gα subenheten C-terminus. Denne strukturen er viktig både for G-protein aktivering av GPCR 4 og G-protein utvalg 5-6. Følgelig tilveiebringer Gα C-terminus en viktig sammenheng mellom ligand stimulering av GPCR og selektiv G-protein aktivering.
Forskning det siste tiåret tyder på at GPCRs fylle en bred conformational landskap, med ligand-bindende stabiliserende undergrupper av GPCR konformasjoner. Mens flere teknikker, inkludert krystallografi, NMR-spektroskopi og fluorescens, og massespektrometri er tilgjengelige for å undersøke GPCR konformasjonell landskapet, er det en mangelen av tilnærminger for å belyse deres funksjonelle betydning i effektor utvalg 7. Her skisserer vi en Fӧrster resonans energi overføring (FRET) -basert tilnærming til å oppdage G protein-selektive GPCR konformasjoner. FRET er avhengig av nærheten og orienteringen av to parallelle fluoroforer med overlappende emisjon (donor) ennd eksitasjon (akseptor) spektra 8. Som donor og akseptor fluoroforer komme nærmere hverandre som et resultat av enten konformasjonell forandring i protein eller et protein-protein interaksjon, den FRET mellom dem øker, og kan måles ved hjelp av en rekke metoder 8. FRET-basert biosensorer har vært ansatt i stor utstrekning i GPCR felt 9. De har blitt anvendt for å probe conformation forandringer i GPCR ved innføring av donor og akseptor i den tredje intracellulære løkke og GPCR C-terminale ende; sensorer har blitt designet for å undersøke GPCR og effektor interaksjoner med separat merking av GPCR og effektor (G protein subenheter / arrestins) med en FRET par 10; enkelte sensorer også detektere konformasjonsendringer i G-proteinet 11. Disse biosensorer har aktivert feltet for å spørre en rekke utestående spørsmål inkludert konformasjonsforandringer endringer i GPCR og effektor, GPCR-effektor interaksjonskinetikk og allosteriske ligander 12. vår gruppevar spesielt interessert i å skape en biosensor som kan oppdage G protein-spesifikke GPCR conformations etter agonist-drevet forhold. Dette biosensor er avhengig av en nylig utviklet teknologi kalt krampe (systematisk protein affinitet styrke modulation) 13. Krampe innebærer tethering samspill proteindomener som bruker en ER / K linker, som styrer deres effektive konsentrasjoner. Flankerer linker med en FRET par fluorophores skaper et verktøy som kan rapportere tilstanden av samspillet mellom proteiner 12. Tidligere pt krampe modulen ble brukt til å tjore Gα C-terminalen til en GPCR og overvåke deres interaksjon med FRET fluoroforer, mCitrine (referert til i denne protokollen ved sin allment kjent variant, gul fluoriserende protein (YFP), eksitasjon / emisjon topp på 490/525 nm) og mCerulean (referert til i denne protokollen ved sin allment kjent variant Cyan Fluorescent Protein (CFP), eksitasjon / emisjonstopp 430/475 nm). Fra N- til C-terminus, thans genetisk kodede enkelt polypeptid inneholder: en full lengde GPCR, FRET-akseptor (mCitrine / YFP), 10 nm ER / K linker, FRET donor (mCerulean / CFP), og den Gα C-terminale peptid. I denne studien, er følere forkortet som GPCR-linker lengde-Gα peptid. Alle komponentene er separert med et ustrukturert (Gly-Ser-Gly) 4-linkeren som muliggjør fri rotasjon av hvert domene. Den detaljerte karakteriseringen av slike sensorer er tidligere utført ved hjelp av to prototypiske GPCR: β 2-AR og opsin 1.
Denne sensoren er transient transfektert inn i HEK-293T-celler og fluorometer-basert live celleforsøk måler fluorescens-spektrene for de FRET paret i vilkårlige enheter av tellinger pr sekund (CPS) i nærvær eller fravær av ligand. Disse målingene brukes til å beregne en FRET forholdet mellom fluorophores (YFP max / CFP max). En endring i FRET (ΔFRET) blir deretter beregnet ved å subtrahere den gjennomsnittlige FRET forholdetav ubehandlede prøver fra FRET mellom ligand behandlede prøver. ΔFRET kan sammenlignes på tvers av konstruksjoner (β 2-AR-10 nm-Gas peptid versus beta 2-AR-10 nm-no peptid). Her har vi detalj protokollen for å uttrykke disse sensorene i levende HEK-293T celler, overvåke deres uttrykk, og oppsettet, gjennomføring og analyse av fluorometer-basert live celle FRET måling for ubehandlet versus legemiddelbehandlede forhold. Selv om denne protokollen er spesifikk for den β 2-AR-10 nm-Gas peptid sensor behandlet med 100 uM isoproterenol bitartrat, kan det være optimalisert for forskjellige GPCR-Gα par og ligander.
Den tette dynamisk område på FRET målinger i dette systemet forsterker behovet for følsomme kvalitetskontroll i hvert trinn av denne protokollen. De viktigste tiltak for å sikre en vellykket FRET eksperiment er 1) celledyrking, 2) transfeksjon 3) protein uttrykk og 4) rettidig, nøyaktig koordinering under analysen utførelse.
Cell helse og vedlikehold / plating kvalitet kan ha en betydelig innvirkning på signal-til-støy av den eksperimentelle systemet og dårlig celle helse kan gjør…
The authors have nothing to disclose.
RUM ble finansiert av American Heart Association Pre-doktor Fellowship (14PRE18560010). Forskningen ble finansiert av American Heart Association Scientist Development Grant (13SDG14270009) og NIH (1DP2 CA186752-01 & 1-R01-GM-105646-01-A1) til SS
B2-AR-10 nm- Gas peptide sensor | Addgene | 47438 | https://www.addgene.org/Sivaraj_Sivaramakrishnan/ |
GeneJET Plasmid Miniprep Kit | Fermentas/Fisher Sci | FERK0503 | Elute in 2 mM Tris elution buffer |
HEK-293T-Flp-n cells | Life Technologies | R78007 | |
Trypsin (0.25%) | Life Technologies | 25200056 | |
DMEM- high glucose | Life Technologies | 11960-044 | Warm in 37 °C water bath before use |
FBS, certified, Heat inactivated, US origin | Life Technologies | 10082147 | |
Glutamax I 100x | Life Technologies | 35050061 | |
HEPES | Corning | MT25060CL | |
Opti-MEM | Life Technologies | 31985-070 | Reduced serum media; Bring to room temperature before use |
XtremeGene HP transfection reagenet | Roche | 6366236001 | Highly recommended for its consistency. Bring to room temperature before use |
FluoroMax 4 | Horiba | Use with FluorEssence V3.8 software | |
3-mm path length quartz cuvette | Starna | NC9729944(16.45F-Q-3/z8.5) | May require cuvette holder/adaptor for use in Fluorometer, available from Starna |
Sc100-S3 Heated Circulating water bath pump | Fisher Scientific | 13-874-826 | Warm to 37 °C before use |
Thermomixer Heat Block | Eppendorf | 22670000 | Warm to 37 °C before use |
Ultrapure DNA/RNAse free water | Life Technologies | 10977015 | Use at room temperature |
D(+)-glucose, anhydrous | Sigma | G5767 | |
aprotinin from bovine lung | Sigma | A1153 | |
leupeptin hemisulfate | EMD | 10-897 | |
L-ascorbic acid, reagent grade | Sigma | A0278 | |
(-)-isoproterenol (+)-bitartrate | Sigma | I2760 | Use fresh aliquot each experiment |