LED Thermo Flow - Combinando optogenética com Citometria de Fluxo
Summary
Optically controlled substances are powerful tools to study signaling pathways. To expand the spectrum of possible experiments, we developed a device for studying optically controlled substances in real time using flow cytometry: the LED Thermo Flow.
Abstract
Optogenetic tools allow isolated, functional investigations of almost any signaling molecule within complex signaling pathways. A major obstacle is the controlled delivery of light to the cell sample and hence the most popular tools for optogenetic studies are microscopy-based cell analyses and in vitro experiments. The flow cytometer has major advantages over a microscope, including the ability to rapidly measure thousands of cells at single cell resolution. However, it is not yet widely used in optogenetics. Here, we present a device that combines the power of optogenetics and flow cytometry: the LED Thermo Flow. This device illuminates cells at specific wavelengths, light intensities and temperatures during flow cytometric measurements. It can be built at low cost and be used with most common flow cytometers. To demonstrate its utility, we characterized the photoswitching kinetics of Dronpa proteins in vivo and in real time. This protocol can be adapted to almost all optically controlled substances and substantially expands the set of possible experiments. More importantly, it will greatly simplify the discovery and development of new optogenetic tools.
Introduction
Optogenetic ferramentas têm vindo a ganhar popularidade, em parte, porque podem ser usadas para decifrar a fiação das vias de sinalização 1-4. Eles baseiam-se na capacidade das proteínas fotoactiváveis para alterar a sua conformação e ligação de afinidade quando iluminada com luz. Combinando estas proteínas de elementos de sinalização permite a regulação específica de um único jogador dentro de complexas vias de sinalização intracelular 5-12. Consequentemente, uma via de sinalização pode ser estudada com alta resolução temporal e espacial.
A maioria dos estudos optogenetic baseados em células utilizam métodos baseados em microscopia combinados com a cultura na presença de luz, seguido por análise bioquímica 11,12. Em contraste, um citómetro de fluxo singulariza células ao longo de um capilar e mede o tamanho da célula, granularidade e intensidades de fluorescência. Este método tem grandes vantagens em relação a microscopia ou bioquímicos métodos, incluindo a capacidade de analisar thousands de células na resolução de uma única célula vivendo em um tempo muito curto. Por isso, é desejável combinar Optogenetics com a citometria de fluxo.
Para nosso conhecimento, não existe um protocolo estabelecido para citometria de fluxo optogenética. Um procedimento amplamente aceito é iluminar manualmente células de fora do tubo de reacção com dispositivos lanterna. No entanto, a iluminação manual no fluxo requer citómetro que a luz passe através do tubo de reacção e, para a imagem de células vivas, uma forma cilíndrica, da câmara de água aquecida. Isto faz com que a dispersão de luz substancial e perda de luz. Além disso, a intensidade da luz fornecida pela iluminação manual não é reprodutível entre experiências (ângulo, a distância, etc.) e não há um limite prático para o número de comprimentos de onda em um experimento.
Ao construir o dispositivo LED Thermo Flow, fomos capazes de superar essas limitações. Com este dispositivo, as células podem ser iluminados com determinados comprimentos de onda em um tempforma durante as medições de citometria de fluxo controlado-ratura. Isto permite a quantidades precisas e reprodutíveis de luz dentro e entre experimentos.
Para demonstrar a utilidade do nosso dispositivo in vivo, nós gravado o sinal de fluorescência de Dronpa em células B Ramos durante photoswitching. células B Ramos são derivados a partir de um linfoma de Burkitt humano. Dronpa é uma proteína fluorescente que existe como um monómero, dímero ou tetrâmero. Na sua forma monomérica, é não fluorescente. Iluminação com 400 nm de luz induz dimerização e tetramerização e torna a Proteína Fluorescente Dronpa. Este processo pode ser invertido por iluminação com luz de 500 nm. A proteína Dronpa tem sido utilizado para controlar a função e localização de proteínas de sinalização 4,13.
Aqui, nós expressa uma proteína Dronpa-Linker-Dronpa em células B Ramos para estudar photoswitching de Dronpa em um citômetro de fluxo. Usando o nosso dispositivo, fomos capazes de forma eficiente ereproducibly PHOTOSWITCH Dronpa durante a gravação de sua intensidade de fluorescência em tempo real. Este método oferece vantagens substanciais através de protocolos de iluminação atuais com iluminação manual e amplia significativamente o repertório experimental para obter ferramentas optogenética e compostos gaiola. Usando o nosso dispositivo será significativamente simplificar e acelerar a descoberta e desenvolvimento de novas ferramentas optogenética.
Protocol
Representative Results
Discussion
A Thermo Fluxo de LED é um dispositivo inovador para estudar ferramentas optogenética em um citômetro de fluxo.
Até agora, as amostras optogenética foram iluminados apenas com lasers de microscopia ou dispositivos lanterna 11,12. Dependendo do ângulo e distância da lanterna para a amostra, uma variabilidade substancial na quantidade de iluminação está prevista entre experiências. Além disso, há um limite para o número de lanternas uma única pessoa pode operar em um …
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We thank J. Schmidt from the University of Freiburg for constructing the device. We thank P. Nielsen and D. Medgyesi for their support and critical reading of this manuscript. This study was supported by the Deutsche Forschungsgemeinschaft through SFB746 and by the Excellence Initiative of the German Research Foundation (GSC-4, Spemann Graduate School).
Materials
| Glass FACS tube | Thermo Fisher Scientific; Waltham, USA | 14-961-26 | Borosilicate glass tubes 12×75 mm |
| Flow Cytometer | BD Bioscienceg; Heidelberg, Germany | Fortessa II | Special Order |
| Dronpa: pcDNA3-mNeptune2-N | Addgene; Cambridge, USA | 41645 | |
| PolyJet | SignaGen, Rockville, USA | SL100688 | |
| LED 505 nm | Avago Technologies; Boeblingen, Germany | HLMP-CE34-Y1CDD | |
| LED 400 nm | Avago Technologies; Boeblingen, Germany | UV5TZ-400-15 | |
| Plexiglas tube 15 mm | Maertin; Freiburg, Germany | 76999 | |
| Plexiglas 3 mm | Maertin; Freiburg, Germany | 692230 | |
| Plexiglas 2,5 mm | Maertin; Freiburg, Germany | 692225 | |
| Plexiglas 1,5 mm | Maertin; Freiburg, Germany | 692215 | |
| PVC tile 5 mm | Maertin; Freiburg, Germany | 690020.005 | |
| PVC tile 6 mm | Maertin; Freiburg, Germany | 690020.006 | |
| PVC block 50 mm | Maertin; Freiburg, Germany | 690020.050 | |
| RPMI | Invitrogen, Life Technologies; Darmstadt, Germany | 61870-010 | |
| 2-Mercaptoethanol | EMD; Germany | 805740 | |
| FCS | PAN Biotech; Aidenbach, Germany | P30-3302 | |
| Penicillin/Strptomycin (10000 U/ml) | Invitrogen, Life Technologies; Darmstadt, Germany | 15140-122 | |
| Acrifix plexiglas glue | Evonic industries, Essen, Germany | 1R0192 | |
| Tangit PVC-U glue | Henkel, Düsseldorf, Germany |
Referências
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