Analyse von SCAP<em> N</em> -glycosylation Und Handel in menschlichen Zellen
Summary
Wir beschreiben eine modifizierte Methode zur Membranfraktion isoliert von menschlichen Zellen und die Probenvorbereitung für den Nachweis von SCAP N -glycosylation und Gesamtprotein durch Western – Blot verwendet wird . Wir stellen ferner eine GFP-Markierungsverfahren SCAP Handel mittels konfokaler Mikroskopie zu überwachen. Dieses Protokoll kann in regelmäßigen biologischen Laboratorien verwendet werden.
Abstract
Elevated lipogenesis is a common characteristic of cancer and metabolic diseases. Sterol regulatory element-binding proteins (SREBPs), a family of membrane-bound transcription factors controlling the expression of genes important for the synthesis of cholesterol, fatty acids and phospholipids, are frequently upregulated in these diseases. In the process of SREBP nuclear translocation, SREBP-cleavage activating protein (SCAP) plays a central role in the trafficking of SREBP from the endoplasmic reticulum (ER) to the Golgi and in subsequent proteolysis activation. Recently, we uncovered that glucose-mediated N-glycosylation of SCAP is a prerequisite condition for the exit of SCAP/SREBP from the ER and movement to the Golgi. N-glycosylation stabilizes SCAP and directs SCAP/SREBP trafficking. Here, we describe a protocol for the isolation of membrane fractions in human cells and for the preparation of the samples for the detection of SCAP N-glycosylation and total protein by using western blot. We further provide a method to monitor SCAP trafficking by using confocal microscopy. This protocol is appropriate for the investigation of SCAP N-glycosylation and trafficking in mammalian cells.
Introduction
Deregulation des Fettstoffwechsels ist ein gemeinsames Merkmal von Krebs und Stoffwechselerkrankungen 1-6. Bei diesen Verfahren Sterol regulatorische Element-bindende Proteine (SREBPs), eine Familie von Transkriptionsfaktoren, eine wichtige Rolle spielen , um die Expression von Genen , wichtig für die Aufnahme und die Synthese von Cholesterin, Fettsäuren bei der Kontrolle und Phospholipide 7-10.
SREBPs, einschließlich SREBP-1a, SREBP-1c und SREBP-2, werden als inaktive Vorstufen synthetisiert, 7 durch zwei Transmembrandomänen an das endoplasmatische Retikulum (ER) -Membran binden. Der N-Terminus von SREBPs enthält eine DNA-Bindungsdomäne für die Transaktivierung von Zielgenen 11. Der C-Terminus von SREBP Vorläufer bindet an SREBP Spaltungs-aktivierendes Protein (SCAP) 12,13, einem polytopen Membranprotein , das eine zentrale Rolle in der Regulation der SREBP Stabilität und Aktivierung spielt 14-16.
Die Umsettation der Transkriptionsfunktion erfordert die Translokation des SCAP / SREBP – Komplexes aus dem ER zum Golgi, wo zwei Proteasen sequentiell SREBP spalten und dessen N-terminales Fragment freizusetzen, die dann in den Kern 7 für die Transaktivierung von Genen lipogenic eintritt. Bei diesen Verfahren steuern die Pegel von Sterolen in der ER – Membran den Ausgang des SCAP / SREBP – Komplexes aus dem ER 7,17. Unter hohem Sterin Bedingungen bindet Sterin SCAP oder ER-resident Insulin-induzierte Gen-Protein-1 (Insig-1) oder -2 (Insig-2), die Verbesserung der Vereinigung von SCAP mit Insigs, die die SCAP / SREBP-Komplex in der Retain ER 18-20. Wenn Sterin-Spiegel senken, distanziert SCAP mit Insigs. Dies führt zu einer SCAP Konformationsänderung, die SCAP Wechselwirkung mit gemeinsamen Hüllproteine (COP) II-Komplexes ermöglicht. Der Komplex vermittelt die Einbindung des SCAP / SREBP Komplexes in die angehenden Bläschen und lenkt seinen Transport aus dem ER zum Golgi 21,22. Nach TransLocation zum Golgi, SREBPs sequentiell von Standort 1 und Standort-2 – Proteasen gespalten, was zur Freisetzung des N-Terminus 7,23-29.
SCAP Protein trägt drei N -verknüpftem Oligosaccharide an Asparagin (N) positioniert N263, N590 und N641 15. Wir vor kurzem ergeben , dass Glukose-vermittelten N -glycosylation von SCAP in diesen Seiten eine Vorbedingung ist für SCAP / SREBP Handel vom ER zum Golgi unter niedrigen Sterin Bedingungen 30-32. Der Verlust der SCAP Glykosylierung über Mutation aller drei Asparagin Glutamin (NNN zu QQQ) deaktiviert den Handel des SCAP / SREBP komplex und führt zur Instabilität der SCAP – Protein und die Verringerung der SREBP Aktivierung 31. Unsere jüngsten Daten zeigen auch , dass SREBP-1 ist stark in Glioblastoma aktiviert und reguliert durch SCAP N -glycosylation 4,31,33,34. Targeting SCAP / SREBP-1-Signalisierung zeichnet sich als eine neue Strategie malignen Erkrankungen und Stoffwechsel s zu behandelnyndromes 1,3,35-38. Daher ist es wichtig , eine effektive Methode zu entwickeln SCAP – Protein und N -glycosylation Ebenen und überwachen ihre Handels mit menschlichen Zellen und Geweben Patienten zu analysieren.
Die luminalen Bereich von SCAP – Protein (Aminosäuren 540-707) in der ER enthält zwei N -glycosylation Stellen (N590 und N641) , die von Proteolyse geschützt sind , wenn intakten Membranen mit 15 Trypsin behandelt werden. Dieses luminalen Fragment ein Molekulargewicht von ~ 30 kDa , das klein genug ist , um die Auflösung der einzelnen glykosylierten Varianten SCAP durch Natriumdodecylsulfat – Polyacrylamid – Gelelektrophorese (SDS-PAGE) 15,31 zu ermöglichen. Hier stellen wir ein Verfahren N -glycosylation von SCAP und das Gesamtprotein in menschlichen Zellen zu detektieren. Dieses Protokoll wird von der Methode in den Publikationen von der Brown und Goldstein Labor beschrieben abgeleitet 15 und unsere jüngste Veröffentlichung 31. Das Protokoll kann in t verwendet werdener studieren von SCAP-Protein aus Säugerzellen.
Protocol
Representative Results
Discussion
In dieser Studie beschreiben wir ein Protokoll für die Isolierung von Membranfraktionen in menschlichen Zellen und für die Herstellung der Proben für den Nachweis von SCAP N -glycosylation und Gesamtprotein durch Western – Blot verwendet wird . Wir bieten weiterhin ein Verfahren SCAP Handel zu überwachen, indem GFP-Markierung und der konfokalen Mikroskopie. Das Verfahren ist speziell verwendete Membranprotein zu analysieren und ist ein wichtiges Instrument SCAP N -glycosylation und Menschenhandel z…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We are grateful to Drs. Mike S. Brown and Joseph L. Goldstein for their agreement to publish this method according to the methods described in their publications. We appreciate Dr. Peter Espenshade for sharing the GFP-SCAP plasmid. This work was supported by NIH grants NS072838 and NS079701 to D.G., American Cancer Society Research Scholar Grant RSG-14-228-01-CSM to D.G., and OSUCCC Pelotonia Postdoctoral Fellowship to C.C. We also appreciate the support from the Ohio State Neuroscience Core (P30 NS038526) and OSUCCC Translational Therapeutic Program seed grant and start-up funds to D.G.
Materials
| X-treme GENE HP DNA Transfection Reagent | Roche | 6366236001 | |
| Opti-MEMI medium | Life Technologies | 31985-070 | |
| trypsin | Sigma | T6567 | |
| soybean trypsin inhibitor | Sigma | T9777 | |
| PNGase F | Sigma | P7367 | |
| Anti-SCAP (9D5) antibody | Santa Cruz | sc-13553 | |
| GFP antibody | Roche | 11814460001 | |
| SREBP-1 antibody (IgG-2A4) | BD Pharmingen | 557036 | |
| PDI Antibody (H-17) | Santa Cruz | sc-30932 | |
| Lamin A Antibody (H-102) | Santa Cruz | sc-20680 | |
| SCAP antibody (a.a 450-500) | Bethyl Laboratories, Inc. | A303-554A | |
| Dulbecco’s modified Eagle’s medium (DMEM) without glucose, pyruvate and glutamine | Cellgro | 17-207-CV | Add 1 Mm Pyravate and 4 mM Glutamine before use |
| 22G x 1 1/2 needle | BD | 305156 | |
| pepstatin A | Sigma | P5318 | |
| leupeptin | Sigma | L2884 | |
| PMSF | Sigma | P7626 | |
| DTT | Sigma | 43819 | |
| ALLN | Sigma | A6185 | |
| Nitrocellulose membrane | GE | RPN3032D | |
| EDTA Solution 0.5 M PH8.5 100 ml | VWR | 82023-102 | |
| EGTA 0.5 M sterile (PH 8.0) 50 ml | Fisher Scentific | 50255956 | |
| HyClone FBS | Thermo scientific | SH3007103 | |
| glycerol | Sigma | G5516 | |
| β-mercaptoethanol | Sigma | M3148 | |
| bromophenol blue | Sigma | B8026 | |
| prolong gold antifade reagent with dapi | life technologies | P36935 | |
| L-glutamine (200 mM) | life technologies | 25030081 | |
| sodium pyruvate | life technologies | 11360-070 |
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