SCAP의 분석<em> N</em> 인간 세포의 -glycosylation 및 매매
Summary
우리는 웨스턴 블롯을 사용하여 SCAP의 N의 -glycosylation 총 단백질의 검출을위한 인간 세포로부터 세포막 분획의 분리 및 샘플 제조 수정 방법을 설명한다. 우리는 더 공 초점 현미경을 사용하여 SCAP 거래를 모니터링하는 GFP-표시 방법을 소개합니다. 이 프로토콜은 일반 생물학 실험실에서 사용될 수있다.
Abstract
Elevated lipogenesis is a common characteristic of cancer and metabolic diseases. Sterol regulatory element-binding proteins (SREBPs), a family of membrane-bound transcription factors controlling the expression of genes important for the synthesis of cholesterol, fatty acids and phospholipids, are frequently upregulated in these diseases. In the process of SREBP nuclear translocation, SREBP-cleavage activating protein (SCAP) plays a central role in the trafficking of SREBP from the endoplasmic reticulum (ER) to the Golgi and in subsequent proteolysis activation. Recently, we uncovered that glucose-mediated N-glycosylation of SCAP is a prerequisite condition for the exit of SCAP/SREBP from the ER and movement to the Golgi. N-glycosylation stabilizes SCAP and directs SCAP/SREBP trafficking. Here, we describe a protocol for the isolation of membrane fractions in human cells and for the preparation of the samples for the detection of SCAP N-glycosylation and total protein by using western blot. We further provide a method to monitor SCAP trafficking by using confocal microscopy. This protocol is appropriate for the investigation of SCAP N-glycosylation and trafficking in mammalian cells.
Introduction
지질 대사의 규제 완화는 암과 대사성 질환 1-6의 일반적인 특성이다. 이러한 프로세스에서, 스테롤 조절 요소 결합 단백질 (SREBPs) 전사 인자의 계열은 흡수 및 콜레스테롤, 지방산의 합성 및 인지질 7-10에 중요한 유전자의 발현을 조절하는 중요한 역할을한다.
SREBP-1a에서, SREBP-1C 및 SREBP-2를 포함 SREBPs는 두 개의 횡단 도메인 (7)의 미덕에 의해 소포체 (ER) 막에 결합 비활성 전구체로 합성된다. SREBPs의 N 말단이 표적 유전자 (11)의 전이 활성화를위한 DNA 결합 도메인이 포함되어 있습니다. SREBP 전구체의 C- 말단 절단 SREBP-활성화 단백질 (SCAP) (12, 13), SREBP 안정성 14-16 활성의 조절에 중추적 인 역할을하는 polytopic 막 단백질에 결합한다.
implemen전사 기능 테이션은 두 단백질 분해 효소가 순차적으로 SREBP을 절단하고 지방을 생성하는 유전자 (7)의 전이 활성화의 핵으로 들어간다는 N- 말단 단편을 해제 골지에 응급실에서 SCAP / SREBP 복합체의 전위가 필요합니다. 이 과정에서, ER 막에 스테롤의 수준은 ER 7,17에서 SCAP / SREBP 복합체의 종료를 제어 할 수 있습니다. 높은 스테롤 조건 스테롤은 SCAP 또는 ER 상주 결합 인슐린 – 유도 유전자 단백질 -1 (Insig-1) 또는 -2 (Insig-2)에서 SCAP / SREBP 착체를 보유 Insigs으로 SCAP의 연결을 강화 ER 18 ~ 20. 스테롤 수치가 감소하면, SCAP는 Insigs로 해리. 이것은 일반적인 코트 단백질 (COP) II 단지와 SCAP 상호 작용을 할 수있는 SCAP 구조적 변화로 이어집니다. 복잡한 신진 소포로 SCAP / SREBP 복합체의 결합을 매개하고 골지 (21, 22)에 ER에서의 전송을 지시합니다. transloc시골지에 ATION, SREBPs 순차적으로 N 말단 7,23-29의 출시로 이어지는 사이트 1 및 사이트-2 단백질 분해 효소에 의해 분해된다.
SCAP 단백질 N은 아스파라긴에 올리고당을 -linked 세 운반 (N)는 N263, N590과 N641 (15)를 배치합니다. 우리는 최근이 사이트에서 SCAP의 포도당 매개 N의 -glycosylation 낮은 스테롤 조건 30-32에서 골지체로 ER에서 SCAP / SREBP 거래를위한 필수 조건입니다 것으로 나타났습니다. (NNN은 QQQ하는) 글루타민에 세 아스파라긴의 돌연변이를 통해 SCAP의 글리코 실화의 손실 SCAP의 단백질과 SREBP 활성화 (31)의 감소의 불안정성에 SCAP / SREBP의 복잡하고 결과의 인신 매매를 사용하지 않습니다. 우리의 최근의 데이터는 또한 SREBP-1의 높은 아교 모세포종에서 활성화 및 SCAP의 N -glycosylation 4,31,33,34에 의해 규제됩니다 보여줍니다. 타겟팅 SCAP / SREBP-1 신호는 악성 종양과 신진 대사의 치료에 새로운 전략으로 부상1,3,35-38 yndromes. 따라서, SCAP 및 N 단백질의 수준을 분석 -glycosylation 인간 세포 및 환자 조직에서의 피킹을 모니터링하기위한 효과적인 방법을 개발하는 것이 중요하다.
응급실에서 SCAP 단백질 (아미노산 540-707)의 내강 영역은 그대로 막은 트립신 (15)으로 처리 할 때 단백질 분해로부터 보호되는 두 개의 N의 -glycosylation 사이트 (N590과 N641)가 포함되어 있습니다. 이 내강 단편 나트륨 도데 실 설페이트 폴리 아크릴 아미드 겔 전기 영동 (SDS-PAGE)에 의해 15,31 SCAP 개별 당화 변형의 해상도를 허용하도록 충분히 작은 ~ 30 kDa의 분자량을 갖는다. 여기서는 N의 SCAP의 -glycosylation 인간 세포에서 전체 단백질을 검출하는 방법을 제공한다. 이 프로토콜은 브라운 및 골드 스타 인 연구소 15하고 최근 출판 (31)로부터의 공보에 기재된 방법으로부터 유도된다. 프로토콜은 t에서 사용될 수있다그는 포유 동물 세포에서 SCAP 단백질의 연구.
Protocol
Representative Results
Discussion
본 연구는 인간 세포의 막 분획을 분리과 웨스턴 블롯을 이용하여 SCAP의 N의 -glycosylation 총 단백질의 검출을위한 시료의 준비를위한 프로토콜을 설명한다. 우리는 더 GFP – 라벨 및 공 초점 현미경을 사용하여 SCAP 거래를 모니터링하는 방법을 제공한다. 이 방법은 구체적으로는, 막 단백질을 분석하는데 사용 된 N SCAP -glycosylation 및 피킹을 조사하기위한 중요한 도구이다.
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The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We are grateful to Drs. Mike S. Brown and Joseph L. Goldstein for their agreement to publish this method according to the methods described in their publications. We appreciate Dr. Peter Espenshade for sharing the GFP-SCAP plasmid. This work was supported by NIH grants NS072838 and NS079701 to D.G., American Cancer Society Research Scholar Grant RSG-14-228-01-CSM to D.G., and OSUCCC Pelotonia Postdoctoral Fellowship to C.C. We also appreciate the support from the Ohio State Neuroscience Core (P30 NS038526) and OSUCCC Translational Therapeutic Program seed grant and start-up funds to D.G.
Materials
| X-treme GENE HP DNA Transfection Reagent | Roche | 6366236001 | |
| Opti-MEMI medium | Life Technologies | 31985-070 | |
| trypsin | Sigma | T6567 | |
| soybean trypsin inhibitor | Sigma | T9777 | |
| PNGase F | Sigma | P7367 | |
| Anti-SCAP (9D5) antibody | Santa Cruz | sc-13553 | |
| GFP antibody | Roche | 11814460001 | |
| SREBP-1 antibody (IgG-2A4) | BD Pharmingen | 557036 | |
| PDI Antibody (H-17) | Santa Cruz | sc-30932 | |
| Lamin A Antibody (H-102) | Santa Cruz | sc-20680 | |
| SCAP antibody (a.a 450-500) | Bethyl Laboratories, Inc. | A303-554A | |
| Dulbecco’s modified Eagle’s medium (DMEM) without glucose, pyruvate and glutamine | Cellgro | 17-207-CV | Add 1 Mm Pyravate and 4 mM Glutamine before use |
| 22G x 1 1/2 needle | BD | 305156 | |
| pepstatin A | Sigma | P5318 | |
| leupeptin | Sigma | L2884 | |
| PMSF | Sigma | P7626 | |
| DTT | Sigma | 43819 | |
| ALLN | Sigma | A6185 | |
| Nitrocellulose membrane | GE | RPN3032D | |
| EDTA Solution 0.5 M PH8.5 100 ml | VWR | 82023-102 | |
| EGTA 0.5 M sterile (PH 8.0) 50 ml | Fisher Scentific | 50255956 | |
| HyClone FBS | Thermo scientific | SH3007103 | |
| glycerol | Sigma | G5516 | |
| β-mercaptoethanol | Sigma | M3148 | |
| bromophenol blue | Sigma | B8026 | |
| prolong gold antifade reagent with dapi | life technologies | P36935 | |
| L-glutamine (200 mM) | life technologies | 25030081 | |
| sodium pyruvate | life technologies | 11360-070 |
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