Vi beskriver en modifierad metod för membranfraktion isolering från humana celler och provberedningen för detektion av SCAP N -glycosylation och totalt protein genom användning av western blöt. Vi introducerar ytterligare en GFP-märkningsmetod för att övervaka SCAP handel med hjälp av konfokalmikroskopi. Detta protokoll kan användas i vanliga biologiska laboratorier.
Elevated lipogenesis is a common characteristic of cancer and metabolic diseases. Sterol regulatory element-binding proteins (SREBPs), a family of membrane-bound transcription factors controlling the expression of genes important for the synthesis of cholesterol, fatty acids and phospholipids, are frequently upregulated in these diseases. In the process of SREBP nuclear translocation, SREBP-cleavage activating protein (SCAP) plays a central role in the trafficking of SREBP from the endoplasmic reticulum (ER) to the Golgi and in subsequent proteolysis activation. Recently, we uncovered that glucose-mediated N-glycosylation of SCAP is a prerequisite condition for the exit of SCAP/SREBP from the ER and movement to the Golgi. N-glycosylation stabilizes SCAP and directs SCAP/SREBP trafficking. Here, we describe a protocol for the isolation of membrane fractions in human cells and for the preparation of the samples for the detection of SCAP N-glycosylation and total protein by using western blot. We further provide a method to monitor SCAP trafficking by using confocal microscopy. This protocol is appropriate for the investigation of SCAP N-glycosylation and trafficking in mammalian cells.
Avreglering av lipidmetabolismen är en gemensam egenskap av cancer och ämnesomsättningssjukdomar 1-6. I dessa processer, sterol reglerande element bindande proteiner (SREBPs), en familj av transkriptionsfaktorer, spelar en avgörande roll i att kontrollera uttrycket av gener som är viktiga för upptag och syntes av kolesterol, fettsyror och fosfolipider 7-10.
SREBPs, inklusive SREBP-1a, SREBP-1c, och SREBP-2, syntetiseras som inaktiva prekursorer som binder till det endoplasmatiska retiklet (ER) membranet i kraft av två transmembrandomäner 7. N-terminalen av SREBPs innehåller en DNA-bindande domän för transaktiveringen av målgener 11. C-terminalen av SREBP prekursorer binder till SREBP klyvning-aktiverande protein (SCAP) 12,13, en polytopic membranprotein som spelar en central roll i regleringen av SREBP stabilitet och aktivering 14-16.
den genomföranförandet av transkriptions funktion kräver translokationen av POFK / SREBP komplexet från ER till Golgi, där två proteaser sekventiellt klyva SREBP och släppa sin N-terminal fragment, som sedan går in i kärnan för transaktiveringen av lipogen gener 7. I dessa processer, nivåerna av steroler i ER-membranet styra utloppet från POFK / SREBP komplexet från ER 7,17. Under höga sterol förhållanden binder sterol till SCAP eller ER-bosatt insulin-inducerad gen protein-1 (Insig-1) eller -2 (Insig-2), öka associationen av SCAP med Insigs som bibehåller POFK / SREBP komplex i ER 18-20. När sterol-nivån, SCAP dissocierar med Insigs. Detta leder till en POFK konformationsförändring, vilket gör att SCAP interaktion med vanliga höljeproteiner (COP) Il-komplexet. Komplexet förmedlar införlivandet av POFK / SREBP komplex i spirande blåsor och riktar sin transport från ER till Golgi 21,22. upon translocation till Golgi, är SREBPs sekventiellt klyvs av Site-1 och Site-2-proteaser, vilket leder till frisättning av N-terminalen 7,23-29.
SCAP protein bär tre N-kopplade oligosackarider vid asparagin (N) positioner N263, N590 och N641 15. Vi visade nyligen att glukos-medierad N -glycosylation av SCAP i dessa platser är en förutsättning för SCAP / SREBP trafficking från ER till Golgi vid låga sterol förhållanden 30-32. Förlust av SCAP glykosylering via mutation av alla tre asparagin till glutamin (NNN att qqq) inaktiverar handel av POFK / SREBP komplex och resulterar i instabilitet SCAP protein och minskning av SREBP aktivering 31. Våra senaste uppgifterna visar också att SREBP-1 är mycket aktivt i glioblastom och regleras av SCAP N -glycosylation 4,31,33,34. Inriktning SCAP / SREBP-1-signalering framstår som en ny strategi för att behandla maligniteter och metaboliska syndromes 1,3,35-38. Därför är det viktigt att utveckla en effektiv metod för att analysera SCAP protein och N -glycosylation nivåer och övervaka handel med mänskliga celler och patientvävnader.
Den luminala regionen SCAP protein (aminosyror 540-707) i ER innehåller två N -glycosylation platser (N590 och N641) som är skyddade från proteolys när intakta membran behandlas med trypsin 15. Denna luminal fragmentet har en molekylvikt av ~ 30 kDa som är tillräckligt liten för att medge upplösning av individuella glykosylerade varianter av SCAP genom natriumdodecylsulfat-polyakrylamidgelelektrofores (SDS-PAGE) 15,31. Här ger vi en metod för att detektera N -glycosylation av SCAP och totalt protein i humana celler. Detta protokoll kommer från den metod som beskrivs i publikationer från Brown och Goldstein laboratorium 15 och vår senaste publikation 31. Protokollet kan användas i than studie av SCAP protein från däggdjursceller.
I denna studie beskriver vi ett protokoll för isolering av membranfraktioner i mänskliga celler och för beredning av prover för detektion av SCAP N -glycosylation och totalt protein genom Western blöt. Vi tillhandahåller ytterligare en metod för att övervaka SCAP handel med GFP-märkning och konfokalmikroskopi. Metoden används särskilt för att analysera membranprotein och är ett viktigt verktyg för att undersöka SCAP N -glycosylation och trafficking.
Jämfört…
The authors have nothing to disclose.
We are grateful to Drs. Mike S. Brown and Joseph L. Goldstein for their agreement to publish this method according to the methods described in their publications. We appreciate Dr. Peter Espenshade for sharing the GFP-SCAP plasmid. This work was supported by NIH grants NS072838 and NS079701 to D.G., American Cancer Society Research Scholar Grant RSG-14-228-01-CSM to D.G., and OSUCCC Pelotonia Postdoctoral Fellowship to C.C. We also appreciate the support from the Ohio State Neuroscience Core (P30 NS038526) and OSUCCC Translational Therapeutic Program seed grant and start-up funds to D.G.
X-treme GENE HP DNA Transfection Reagent | Roche | 6366236001 | |
Opti-MEMI medium | Life Technologies | 31985-070 | |
trypsin | Sigma | T6567 | |
soybean trypsin inhibitor | Sigma | T9777 | |
PNGase F | Sigma | P7367 | |
Anti-SCAP (9D5) antibody | Santa Cruz | sc-13553 | |
GFP antibody | Roche | 11814460001 | |
SREBP-1 antibody (IgG-2A4) | BD Pharmingen | 557036 | |
PDI Antibody (H-17) | Santa Cruz | sc-30932 | |
Lamin A Antibody (H-102) | Santa Cruz | sc-20680 | |
SCAP antibody (a.a 450-500) | Bethyl Laboratories, Inc. | A303-554A | |
Dulbecco’s modified Eagle’s medium (DMEM) without glucose, pyruvate and glutamine | Cellgro | 17-207-CV | Add 1 Mm Pyravate and 4 mM Glutamine before use |
22G x 1 1/2 needle | BD | 305156 | |
pepstatin A | Sigma | P5318 | |
leupeptin | Sigma | L2884 | |
PMSF | Sigma | P7626 | |
DTT | Sigma | 43819 | |
ALLN | Sigma | A6185 | |
Nitrocellulose membrane | GE | RPN3032D | |
EDTA Solution 0.5 M PH8.5 100 ml | VWR | 82023-102 | |
EGTA 0.5 M sterile (PH 8.0) 50 ml | Fisher Scentific | 50255956 | |
HyClone FBS | Thermo scientific | SH3007103 | |
glycerol | Sigma | G5516 | |
β-mercaptoethanol | Sigma | M3148 | |
bromophenol blue | Sigma | B8026 | |
prolong gold antifade reagent with dapi | life technologies | P36935 | |
L-glutamine (200 mM) | life technologies | 25030081 | |
sodium pyruvate | life technologies | 11360-070 |