Visualisering af IL-22-udtrykkende Lymfocytter Brug Reporter Mus
Summary
We describe here a transgenic reporter mouse model to visualize the IL-22-producing cells inside different mouse tissues. This method can be used to track the location of other cytokines or secretary proteins in the mouse.
Abstract
Reporter mus er ofte blevet brugt til at observere lokalisering af ekspression af målrettede gener. Denne protokol fokuserer på en strategi for at etablere en ny transgen reporter musemodel. Vi valgte at visualisere interleukin (IL) 22-genekspression, fordi dette cytokin har betydelige aktiviteter i tarmen, hvor det bidrager til at reparere væv er beskadiget af inflammation. Reportersystemer giver betydelige fordele frem for andre metoder til at identificere produkter in vivo. I tilfældet med IL-22, havde andre undersøgelser først isoleret celler fra væv og derefter re-stimulerede celler in vitro. IL-22, der normalt secerneres, blev fanget inde celler under anvendelse af et lægemiddel, og intracellulær farvning blev anvendt til at visualisere den. Denne metode identificerer celler i stand til at producere IL-22, men det afgør ikke, om de gjorde det in vivo. Reporter design omfatter indsættelse af et gen for et fluorescerende protein (tdTomato) i IL-22-genet på en sådan way at det fluorescerende protein ikke kan secerneres og derfor forbliver fanget inde i producerende celler in vivo. Fluorescerende producenter kan derefter visualiseres i vævssnit eller ved ex vivo-analyse gennem flowcytometri. Selve byggeprocessen for reporteren inkluderet recombineering en bakteriel kunstigt kromosom, som indeholdt IL-22-genet. Denne manipuleret kromosom blev derefter indført i musegenomet. Homøostatiske IL-22 reporter ekspression blev observeret i forskellige musevæv, herunder milt, thymus, lymfeknuder, Peyerske plak, og tarm, ved hjælp af flowcytometri-analyse. Colitis blev induceret af T-celle (CD4 + CD45RBhigh) overførsel, og reporter udtryk blev visualiseret. Positive T-celler blev første stede i de mesenteriske lymfeknuder og derefter de ophobes inden i lamina propria af de distale tyndtarm og tyktarm væv. Strategien hjælp AKB gav gode-fidelity reporter udtryk i forhold til IL-22 expresnen, og det er enklere end knock-in procedurer.
Introduction
Celletype-specifik ekspression af reportergener er nyttigt at identificere celler aktivt udtrykker målet i væv under homeostatiske og perturberede stater. Det giver også mulighed for oprensning af disse celler, som forbliver levedygtige, at studere deres andre egenskaber. Reporter mus er blevet anvendt til at belyse virkningsmekanismen for specifikke cytokiner, transkriptionsfaktorer og regulatoriske elementer. Tidligere strategier 1, 2, har tre stort set påberåbt sig banke reporter ind i målet locus i musen kromosomet, en tidskrævende og bekostelig procedure. Således er en enklere metode til generering af reporter mus er ønskelig.
Cytokiner er en bred klasse af små, secernerede proteiner / peptider, der regulerer immunresponser gennem intercellulære signalering. Interleukin 22 (IL-22) er et cytokin med mange rapporterede aktiviteter, herunder barriere function, væv reparation, og inflammation 4. Skønt IL-22 blev oprindeligt opdaget som en T-celle produkt 5, efterfølgende rapporter vist sin ekspression i naturlige dræberceller (NK) celler hos mennesker 6 og mus 7 og i andre klasser af medfødte lymfocytter 8. Trods omfattende observation af IL-22-celler, visualisering af IL-22 tidligere krævede ex vivo-stimulering og permeabilisering for pletter med antistoffer. Derfor ville hidtil ukendte IL-22 reporter mus være et meget nyttigt værktøj til at undersøge funktionen af IL-22 i homeostatiske og patogene processer.
Her har vi udviklet et forenklet transgen reporter musemodel at observere IL-22-producerende celler in vivo og in vitro. Ved hjælp af en BAC recombineering metode 9, vi indsat tdTomato cDNA sekvensen med Poly et signal fragmenter i IL-22 locos og erstattet exon 1. De andre utranslaterede regioner, exoner og regulerende elementer blev ikke forstyrres, da vi gerne vil efterligne den naturlige regulering af IL-22 så meget som muligt. Stedet for reporter insertion forstyrrer signalsekvensen, hvilket resulterer i akkumulering af reporteren inde i producerende celler, i modsætning til IL-22 selv, som hurtigt udskilles. Denne nye metode kan også anvendes til generering af reporter-mus for andre secernerede proteiner.
Protocol
Representative Results
Discussion
IL-22 spiller en vigtig rolle i medfødte værtsforsvar og vævsremodellering. IL-22-celler er blevet identificeret ex vivo ved intracellulær farvning. Dog stadig vanskeligt at spore IL-22-ekspression in situ, i normal tilstand eller i inflammatoriske tilstande. Denne protokol beskriver en hidtil ukendt fremgangsmåde til at udvikle en IL-22 reporter musemodel, hvilket gør det muligt at lokalisere reporter-udtrykkende celler in vivo. Reporter gen, der koder TdTomato blev indsat i IL-22 locus…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We thank Kelli Czarra and Megan Karwan for animal technical assistance, Kathleen Noer and Roberta Matthai for flow cytometry assistance, and Donna Butcher andMiriam R. Anver for pathology analysis. This project was supported by a grant from the Ely and Edythe Broad Foundation (to Scott Durum) and has been funded in whole or in part with federal funds from the National Cancer Institute, National Institutes of Health, under Contract No. HHSN261200800001E (MRA).
Materials
| RP23-401E11 BAC | Thermo Fisher Scientific | RPCI23.C | Need gene ID: 50929 |
| NucleoBond BAC 100 | Takara Clontech | 740579 | |
| PCR SuperMix High Fidelity | Thermo Fisher Scientific | 10790020 | |
| PI-SceI | New England Biolabs | R0696S | |
| SpeI | New England Biolabs | R0133S | |
| LB Broth | Thermo Fisher Scientific | 10855-001 | 1L: 10 g SELECT Peptone 140, 5 g SELECT Yeast Extract, 5 g sodium chloride |
| Anti-mouse CD3 | eBioscience | 11-0031 | |
| Anti-mouse CD4 | eBioscience | 17-0041 | |
| Anti-mouse CD45 | Thermo Fisher Scientific | MCD4530 | |
| Anti-mouse CD45RB | eBioscience | 11-0455 | |
| Anti-mouse RFP | Abcam | Ab62341 | |
| HBSS, no calcium, no magnesium, no phenol red | Thermo Fisher Scientific | 14175145 | KCl, KH2PO4, Na2HPO4, NaHCO3, NaCl, D-Glucose |
| Dnase I | Roche | 10104159001 | |
| ACK lysing buffer | Thermo Fisher Scientific | A1049201 | |
| Percoll | GE healthcare life sciences | 17-0891-01 | |
| Collagenase D | Roche | 11088858001 | |
| Dispase II (neutral protease, grade II) | Roche | 4942078001 | |
| IX70 inverted fluorescence microscope | Olympus | Ask for quote | |
| Nikon Eclipse 80i microscope | Nikon | Ask for quote | |
| Dynal shaker | Electron Microscopy Science | 61050-10 | |
| FACSAria | BD Bioscience | Ask for quote | |
| LSRII SORP/flow cytometry | Becton, Dickinson and Company | Ask for quote |
Referências
- Awasthi, A., et al. Cutting edge: IL-23 receptor gfp reporter mice reveal distinct populations of IL-17-producing cells. J Immunol. 182, 5904-5908 (2009).
- Price, A. E., Reinhardt, R. L., Liang, H. E., Locksley, R. M. Marking and quantifying IL-17A-producing cells in vivo. PLoS One. 7, e39750 (2012).
- Kamanaka, M., et al. Expression of interleukin-10 in intestinal lymphocytes detected by an interleukin-10 reporter knockin tiger mouse. Immunity. 25, 941-952 (2006).
- Sonnenberg, G. F., Fouser, L. A., Artis, D. Border patrol: regulation of immunity, inflammation and tissue homeostasis at barrier surfaces by IL-22. Nat Immunol. 12, 383-390 (2011).
- Dumoutier, L., Louahed, J., Renauld, J. C. Cloning and characterization of IL-10-related T cell-derived inducible factor (IL-TIF), a novel cytokine structurally related to IL-10 and inducible by IL-9. J Immunol. 164, 1814-1819 (2000).
- Cella, M., et al. A human natural killer cell subset provides an innate source of IL-22 for mucosal immunity. Nature. 457, 722-725 (2009).
- Sanos, S. L., et al. RORgammat and commensal microflora are required for the differentiation of mucosal interleukin 22-producing NKp46+ cells. Nat Immunol. 10, 83-91 (2009).
- Spits, H., et al. Innate lymphoid cells–a proposal for uniform nomenclature. Nat Rev Immunol. 13, 145-149 (2013).
- Mazzucchelli, R. I., et al. Visualization and identification of IL-7 producing cells in reporter mice. PLoS One. 4, e7637 (2009).
- Shen, W., Hixon, J. A., McLean, M. H., Li, W. Q., Durum, S. K. IL-22-Expressing Murine Lymphocytes Display Plasticity and Pathogenicity in Reporter Mice. Front Immunol. 6, 662 (2015).
- Gong, S., Yang, X. W., Li, C., Heintz, N. Highly efficient modification of bacterial artificial chromosomes (BACs) using novel shuttle vectors containing the R6Kgamma origin of replication. Genome Res. 12, 1992-1998 (2002).
- Shen, W., Huang, Y., Tang, Y., Liu, D. P., Liang, C. C. A general method to modify BACs to generate large recombinant DNA fragments. Mol Biotechnol. 31, 181-186 (2005).
- Cho, A., Haruyama, N., Kulkarni, A. B. Generation of transgenic mice. Curr Protoc Cell Biol. Chapter. Chapter 19, Unit 19 11 (2009).
- Danneman, P. J., Stein, S., Walshaw, S. O. Humane and practical implications of using carbon dioxide mixed with oxygen for anesthesia or euthanasia of rats. Lab Anim Sci. 47, 376-385 (1997).
- Omata, Y., et al. Isolation of coccidian enteroepithelial stages of Toxoplasma gondii from the intestinal mucosa of cats by Percoll density-gradient centrifugation. Parasitol Res. 83, 574-577 (1997).
- Kumar, N., Borth, N. Flow-cytometry and cell sorting: an efficient approach to investigate productivity and cell physiology in mammalian cell factories. Methods. 56, 366-374 (2012).
- Fischer, A. H., Jacobson, K. A., Rose, J., Zeller, R. Cryosectioning tissues. CSH Protoc. 2008, pdb.prot4991 (2008).
- Hilbe, W., et al. Comparison of automated cellular imaging system and manual microscopy for immunohistochemically stained cryostat sections of lung cancer specimens applying p53, ki-67 and p120. Oncol Rep. 10, 15-20 (2003).
- Suzuki, Y., Furukawa, M., Abe, J., Kashiwagi, M., Hirose, S. Localization of porcine trappin-2 (SKALP/elafin) in trachea and large intestine by in situ hybridization and immunohistochemistry. Histochem Cell Biol. 114, 15-20 (2000).
- Wolk, K., et al. IL-22 increases the innate immunity of tissues. Immunity. 21, 241-254 (2004).
- Brand, S., et al. IL-22 is increased in active Crohn’s disease and promotes proinflammatory gene expression and intestinal epithelial cell migration. Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol. 290, G827-G838 (2006).
- Nagalakshmi, M. L., Rascle, A., Zurawski, S., Menon, S., Waal Malefyt, d. e., R, Interleukin-22 activates STAT3 and induces IL-10 by colon epithelial cells. Int Immunopharmacol. 4, 679-691 (2004).
- Maloy, K. J., Powrie, F. Intestinal homeostasis and its breakdown in inflammatory bowel disease. Nature. 474, 298-306 (2011).
- Andoh, A., et al. Interleukin-22, a member of the IL-10 subfamily, induces inflammatory responses in colonic subepithelial myofibroblasts. Gastroenterology. 129, 969-984 (2005).
- Bhan, A. K., Mizoguchi, E., Smith, R. N., Mizoguchi, A. Colitis in transgenic and knockout animals as models of human inflammatory bowel disease. Immunol Rev. 169, 195-207 (1999).
- Mombaerts, P., et al. Spontaneous development of inflammatory bowel disease in T cell receptor mutant mice. Cell. 75, 274-282 (1993).
- Powrie, F. Immune regulation in the intestine: a balancing act between effector and regulatory T cell responses. Ann N Y Acad Sci. 1029, 132-141 (2004).
- Ahlfors, H., et al. IL-22 fate reporter reveals origin and control of IL-22 production in homeostasis and infection. J Immunol. 193, 4602-4613 (2014).
