التصور من الخلايا اللمفاوية معربا-22-IL عن طريق الفئران مراسل
Summary
We describe here a transgenic reporter mouse model to visualize the IL-22-producing cells inside different mouse tissues. This method can be used to track the location of other cytokines or secretary proteins in the mouse.
Abstract
وقد استخدمت الفئران مراسل نطاق واسع لمراقبة توطين التعبير عن الجينات المستهدفة. ويركز هذا البروتوكول على وضع استراتيجية لإنشاء نموذج جديد الماوس مراسل المعدلة وراثيا. لقد اخترنا لتصور انترلوكين التعبير الجيني (IL) 22 لأن هذا خلوى ديه الأنشطة الهامة في الأمعاء، حيث أنه يساهم في إصلاح الأنسجة التالفة من الالتهابات. أنظمة مراسل توفر مزايا كبيرة على غيرها من أساليب تحديد المنتجات في الجسم الحي. في حالة IL-22، وكانت دراسات أخرى معزولة أولا الخلايا من الأنسجة ومن ثم إعادة حفز-الخلايا في المختبر. IL-22، الذي يفرز بشكل طبيعي، كان محاصرا داخل الخلايا باستخدام المخدرات، وكان يستخدم تلطيخ الخلايا إلى تصور ذلك. ويحدد هذا الأسلوب خلايا قادرة على إنتاج IL-22، ولكنها لا تحدد ما إذا كانوا يفعلون ذلك في الجسم الحي. تصميم مراسل يشمل إدخال جين لبروتين فلوري (tdTomato) في الجين IL-22 في مثل هذا واذ أن بروتين فلوري لا يمكن أن يفرز وبالتالي لا يزال محاصرا داخل الخلايا المنتجة في الجسم الحي. ويمكن بعد ذلك المنتجين الفلورسنت أن تصور في أقسام الأنسجة أو خارج الجسم خلال تحليل التدفق الخلوي. وشملت عملية البناء الفعلية لمراسل recombineering كروموسوم اصطناعي البكتيرية التي تحتوي على الجينات IL-22. ثم تم عرض هذا الكروموسوم هندسيا في جينوم الفأر. وقد لوحظ التماثل الساكن IL-22 تعبير المراسل في أنسجة مختلفة الماوس، بما في ذلك الطحال والغدة الصعترية، والعقد اللمفاوية، والتصحيح باير ل، والأمعاء، من خلال تحليل التدفق الخلوي. وقد الناجم عن التهاب القولون عن طريق الخلايا التائية (CD4 + CD45RBhigh) نقل، وتصور التعبير مراسل. كانت خلايا T إيجابية الحالي لأول مرة في الغدد الليمفاوية المساريقي، وبعد ذلك تراكمت داخل الصفيحة المخصوصة الأمعاء والقولون الأنسجة الصغيرة البعيدة. الاستراتيجية باستخدام البكالوريا أعطى التعبير مراسل جيدة الدقة مقارنة IL-22 مورينداتاهيتيانونيسيون، وأنه هو أبسط من الإجراءات تدق في.
Introduction
نوع محدد خلية التعبير عن الجينات مراسل مفيد لتحديد الخلايا معربا بنشاط الهدف في الأنسجة تحت الدول التماثل الساكن وإرتباك. كما يسمح لتنقية هذه الخلايا، التي لا تزال قابلة للحياة، لدراسة خصائص الأخرى. وقد استخدمت الفئران مراسل في توضيح آلية عمل لالسيتوكينات محددة، عوامل النسخ، والعناصر التنظيمية. الاستراتيجيات السابقة 1، 2، 3 اعتمدت إلى حد كبير على ضرب مراسل في مكان الهدف في كروموسوم الماوس، وهو إجراء يستغرق وقتا طويلا ومكلفا. وهكذا، فإن أبسط طريقة لتوليد الفئران مراسل أمر مرغوب فيه.
السيتوكينات هي فئة واسعة من الصغيرة، وبروتينات يفرز / الببتيدات التي تنظم الاستجابات المناعية من خلال الإشارات بين الخلايا. انترلوكين 22 (IL-22) هو خلوى مع العديد ذكرت الأنشطة، بما في ذلك الحاجز فوnction، وإصلاح الأنسجة، والتهاب 4. وعلى الرغم من IL-22 اكتشفت في البداية كمنتج خلايا T 5، أظهرت تقارير لاحقة التعبير عنها في الخلايا القاتلة الطبيعية (NK) في البشر والفئران 6 7 و في فصول أخرى من الخلايا الليمفاوية الفطرية 8. وعلى الرغم من مراقبة شاملة من الخلايا المنتجة-22-IL، تصور IL-22 مطلوبا من قبل التحفيز خارج الحي وpermeabilization إلى البقع مع الأجسام المضادة. ولذلك، فإن رواية IL-22 الفئران مراسل تكون أداة مفيدة جدا للتحقيق وظيفة IL-22 في عمليات التماثل الساكن والمسببة للأمراض.
هنا، قمنا بتطوير نموذج مراسل الماوس المعدلة وراثيا مبسط لمراقبة الخلايا المنتجة للIL-22 في المجراة في المختبر. باستخدام طريقة BAC recombineering 9، نحن إدراج تسلسل tdTomato كدنا] مع بولي وشظايا إشارة إلى الموضع IL-22لنا واستبدال اكسون 1. لم أقلقت المناطق، الإكسونات، وعناصر تنظيمية أخرى غير مترجمة، لأننا نود أن تحاكي تنظيم الطبيعي للIL-22 قدر الإمكان. موقع الإدراج مراسل يعطل تسلسل إشارة، مما أدى إلى تراكم لمراسل داخل الخلايا المنتجة، على عكس IL-22 في حد ذاته، الذي يفرز بسرعة. ويمكن أيضا أن تطبق هذه الطريقة الجديدة للجيل من الفئران مراسل للبروتينات يفرز أخرى.
Protocol
Representative Results
Discussion
IL-22 يلعب دورا أساسيا في الفطري دفاع المضيف والأنسجة التجديد. وقد تم تحديد IL إنتاج 22 الخلايا خارج الجسم عن طريق تلطيخ الخلايا. ومع ذلك، فإنه لا يزال من الصعب تتبع التعبير IL-22 في الموقع، سواء في الحالة العادية أو في حالات الالتهابات. يصف هذا البروتوكول طريقة جد?…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We thank Kelli Czarra and Megan Karwan for animal technical assistance, Kathleen Noer and Roberta Matthai for flow cytometry assistance, and Donna Butcher andMiriam R. Anver for pathology analysis. This project was supported by a grant from the Ely and Edythe Broad Foundation (to Scott Durum) and has been funded in whole or in part with federal funds from the National Cancer Institute, National Institutes of Health, under Contract No. HHSN261200800001E (MRA).
Materials
| RP23-401E11 BAC | Thermo Fisher Scientific | RPCI23.C | Need gene ID: 50929 |
| NucleoBond BAC 100 | Takara Clontech | 740579 | |
| PCR SuperMix High Fidelity | Thermo Fisher Scientific | 10790020 | |
| PI-SceI | New England Biolabs | R0696S | |
| SpeI | New England Biolabs | R0133S | |
| LB Broth | Thermo Fisher Scientific | 10855-001 | 1L: 10 g SELECT Peptone 140, 5 g SELECT Yeast Extract, 5 g sodium chloride |
| Anti-mouse CD3 | eBioscience | 11-0031 | |
| Anti-mouse CD4 | eBioscience | 17-0041 | |
| Anti-mouse CD45 | Thermo Fisher Scientific | MCD4530 | |
| Anti-mouse CD45RB | eBioscience | 11-0455 | |
| Anti-mouse RFP | Abcam | Ab62341 | |
| HBSS, no calcium, no magnesium, no phenol red | Thermo Fisher Scientific | 14175145 | KCl, KH2PO4, Na2HPO4, NaHCO3, NaCl, D-Glucose |
| Dnase I | Roche | 10104159001 | |
| ACK lysing buffer | Thermo Fisher Scientific | A1049201 | |
| Percoll | GE healthcare life sciences | 17-0891-01 | |
| Collagenase D | Roche | 11088858001 | |
| Dispase II (neutral protease, grade II) | Roche | 4942078001 | |
| IX70 inverted fluorescence microscope | Olympus | Ask for quote | |
| Nikon Eclipse 80i microscope | Nikon | Ask for quote | |
| Dynal shaker | Electron Microscopy Science | 61050-10 | |
| FACSAria | BD Bioscience | Ask for quote | |
| LSRII SORP/flow cytometry | Becton, Dickinson and Company | Ask for quote |
Referências
- Awasthi, A., et al. Cutting edge: IL-23 receptor gfp reporter mice reveal distinct populations of IL-17-producing cells. J Immunol. 182, 5904-5908 (2009).
- Price, A. E., Reinhardt, R. L., Liang, H. E., Locksley, R. M. Marking and quantifying IL-17A-producing cells in vivo. PLoS One. 7, e39750 (2012).
- Kamanaka, M., et al. Expression of interleukin-10 in intestinal lymphocytes detected by an interleukin-10 reporter knockin tiger mouse. Immunity. 25, 941-952 (2006).
- Sonnenberg, G. F., Fouser, L. A., Artis, D. Border patrol: regulation of immunity, inflammation and tissue homeostasis at barrier surfaces by IL-22. Nat Immunol. 12, 383-390 (2011).
- Dumoutier, L., Louahed, J., Renauld, J. C. Cloning and characterization of IL-10-related T cell-derived inducible factor (IL-TIF), a novel cytokine structurally related to IL-10 and inducible by IL-9. J Immunol. 164, 1814-1819 (2000).
- Cella, M., et al. A human natural killer cell subset provides an innate source of IL-22 for mucosal immunity. Nature. 457, 722-725 (2009).
- Sanos, S. L., et al. RORgammat and commensal microflora are required for the differentiation of mucosal interleukin 22-producing NKp46+ cells. Nat Immunol. 10, 83-91 (2009).
- Spits, H., et al. Innate lymphoid cells–a proposal for uniform nomenclature. Nat Rev Immunol. 13, 145-149 (2013).
- Mazzucchelli, R. I., et al. Visualization and identification of IL-7 producing cells in reporter mice. PLoS One. 4, e7637 (2009).
- Shen, W., Hixon, J. A., McLean, M. H., Li, W. Q., Durum, S. K. IL-22-Expressing Murine Lymphocytes Display Plasticity and Pathogenicity in Reporter Mice. Front Immunol. 6, 662 (2015).
- Gong, S., Yang, X. W., Li, C., Heintz, N. Highly efficient modification of bacterial artificial chromosomes (BACs) using novel shuttle vectors containing the R6Kgamma origin of replication. Genome Res. 12, 1992-1998 (2002).
- Shen, W., Huang, Y., Tang, Y., Liu, D. P., Liang, C. C. A general method to modify BACs to generate large recombinant DNA fragments. Mol Biotechnol. 31, 181-186 (2005).
- Cho, A., Haruyama, N., Kulkarni, A. B. Generation of transgenic mice. Curr Protoc Cell Biol. Chapter. Chapter 19, Unit 19 11 (2009).
- Danneman, P. J., Stein, S., Walshaw, S. O. Humane and practical implications of using carbon dioxide mixed with oxygen for anesthesia or euthanasia of rats. Lab Anim Sci. 47, 376-385 (1997).
- Omata, Y., et al. Isolation of coccidian enteroepithelial stages of Toxoplasma gondii from the intestinal mucosa of cats by Percoll density-gradient centrifugation. Parasitol Res. 83, 574-577 (1997).
- Kumar, N., Borth, N. Flow-cytometry and cell sorting: an efficient approach to investigate productivity and cell physiology in mammalian cell factories. Methods. 56, 366-374 (2012).
- Fischer, A. H., Jacobson, K. A., Rose, J., Zeller, R. Cryosectioning tissues. CSH Protoc. 2008, pdb.prot4991 (2008).
- Hilbe, W., et al. Comparison of automated cellular imaging system and manual microscopy for immunohistochemically stained cryostat sections of lung cancer specimens applying p53, ki-67 and p120. Oncol Rep. 10, 15-20 (2003).
- Suzuki, Y., Furukawa, M., Abe, J., Kashiwagi, M., Hirose, S. Localization of porcine trappin-2 (SKALP/elafin) in trachea and large intestine by in situ hybridization and immunohistochemistry. Histochem Cell Biol. 114, 15-20 (2000).
- Wolk, K., et al. IL-22 increases the innate immunity of tissues. Immunity. 21, 241-254 (2004).
- Brand, S., et al. IL-22 is increased in active Crohn’s disease and promotes proinflammatory gene expression and intestinal epithelial cell migration. Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol. 290, G827-G838 (2006).
- Nagalakshmi, M. L., Rascle, A., Zurawski, S., Menon, S., Waal Malefyt, d. e., R, Interleukin-22 activates STAT3 and induces IL-10 by colon epithelial cells. Int Immunopharmacol. 4, 679-691 (2004).
- Maloy, K. J., Powrie, F. Intestinal homeostasis and its breakdown in inflammatory bowel disease. Nature. 474, 298-306 (2011).
- Andoh, A., et al. Interleukin-22, a member of the IL-10 subfamily, induces inflammatory responses in colonic subepithelial myofibroblasts. Gastroenterology. 129, 969-984 (2005).
- Bhan, A. K., Mizoguchi, E., Smith, R. N., Mizoguchi, A. Colitis in transgenic and knockout animals as models of human inflammatory bowel disease. Immunol Rev. 169, 195-207 (1999).
- Mombaerts, P., et al. Spontaneous development of inflammatory bowel disease in T cell receptor mutant mice. Cell. 75, 274-282 (1993).
- Powrie, F. Immune regulation in the intestine: a balancing act between effector and regulatory T cell responses. Ann N Y Acad Sci. 1029, 132-141 (2004).
- Ahlfors, H., et al. IL-22 fate reporter reveals origin and control of IL-22 production in homeostasis and infection. J Immunol. 193, 4602-4613 (2014).
