Visualisatie van IL-22-uiting van lymfocyten Met behulp van Reporter Muizen
Summary
We describe here a transgenic reporter mouse model to visualize the IL-22-producing cells inside different mouse tissues. This method can be used to track the location of other cytokines or secretary proteins in the mouse.
Abstract
Reportermuizen zijn op grote schaal gebruikt voor de lokalisatie van de expressie van gerichte genen observeren. Dit protocol richt zich op een strategie om een nieuwe transgene reporter muismodel vast te stellen. We kozen te visualiseren interleukine (IL) 22 genexpressie omdat cytokine heeft belangrijke activiteiten in de darm, waar het bijdraagt aan weefsel beschadigd door ontsteking herstellen. Reportersystemen bieden grote voordelen boven andere werkwijzen voor het identificeren producten in vivo. In het geval van IL-22, had andere studies eerste geïsoleerde cellen uit weefsels en vervolgens opnieuw gestimuleerde cellen in vitro. IL-22, die normaal wordt uitgescheiden, werd opgesloten in cellen met een geneesmiddel, en intracellulaire kleuring werd gebruikt voor het visualiseren. Deze werkwijze identificeert cellen die in staat is IL-22, maar niet bepalen of ze dat deden in vivo. De reporter ontwerp omvat het inbrengen van een gen voor een fluorescerend eiwit (tdTomato) in de IL-22-gen in dergelijke way dat het fluorescerende eiwit kan worden uitgescheiden en derhalve blijft opgesloten in de cellen in vivo. Fluorescerende producenten kunnen vervolgens worden gevisualiseerd in weefselcoupes of door ex vivo analyse door middel van stromingscytometrie. De eigenlijke bouwproces voor de reporter opgenomen recombineering een bacterieel kunstmatig chromosoom dat de IL-22-gen bevatte. Deze gemanipuleerde chromosoom werd vervolgens in het muis genoom. Homeostatische IL-22 reporter expressie werd waargenomen in verschillende muizenweefsels, waaronder de milt, thymus, lymfeklieren, Peyer's patch en darmen, met stroomcytometrie analyse. Colitis werd geïnduceerd door T-cellen (CD4 + CD45RBhigh) overdracht en reporter expressie werd gevisualiseerd. Positieve T cellen werden eerst in de mesenterische lymfeklieren en vervolgens geaccumuleerd zij in de lamina propria van de distale dunne darm en colon weefsel. De strategie van het gebruik van BAC's gaf goede-fidelity reporter uitdrukking in vergelijking met IL-22 expressie en het is eenvoudiger dan knock-in procedures.
Introduction
Celtype-specifieke expressie van reportergenen nuttig om cellen actief expressie het doelwit weefsels onder homeostatische en verstoorde staten identificeren. Het staat ook voor de zuivering van deze cellen die levensvatbaar blijven hun andere eigenschappen te bestuderen. Reportermuizen zijn gebruikt in het ophelderen van het werkingsmechanisme van bepaalde cytokines, transcriptiefactoren en regulerende elementen. Previous strategieën 1, 2, 3 hebben grotendeels gebruikt kloppen de reporter in het doel-locus in de muis chromosoom, een tijdrovende en kostbare procedure. Dus een eenvoudiger werkwijze voor het genereren van reportermuizen gewenst.
Cytokinen zijn een brede klasse van kleine, uitgescheiden eiwitten / peptiden die immuunreacties door middel van intercellulaire signalering reguleren. Interleukine 22 (IL-22) is een cytokine met vele gerapporteerde activiteiten, zoals barrière functies, weefselherstel, en ontsteking 4. Alhoewel IL-22 werd oorspronkelijk ontdekt als een T-celproduct 5, vervolgrapporten toonde de expressie ervan in natural killer (NK) cellen bij de mens en muizen 6 7 en in andere klassen van lymfocyten aangeboren 8. Ondanks uitgebreid observatie van IL-22-producerende cellen visualisatie van IL-22 voorheen ex vivo stimulatie en permeabilisatie vlekken met antilichamen. Daarom zouden nieuwe IL-22 reportermuizen bijzonder nuttig om de functie van IL-22 in homeostatische en pathogene processen onderzoeken.
Hier hebben we een vereenvoudigde reporter transgene muismodel voor de IL-22-producerende cellen te observeren in vivo pt in vitro. Met behulp van een BAC recombineering methode 9, we ingevoegd tdTomato de cDNA sequentie met poly A signaal fragmenten in de IL-22 locons en vervangen exon 1. De andere onvertaalde regio, exons en regulatoire elementen werden niet verstoord, want we willen de natuurlijke regulatie van IL-22 zo goed mogelijk na te bootsen. De plaats van insertie reporter verstoort de signaalsequentie, resulterend in de accumulatie van de reporter in de cellen, in tegenstelling tot IL-22 zelf, die snel wordt uitgescheiden. Deze nieuwe werkwijze kan ook worden toegepast voor het genereren van reportermuizen voor andere uitgescheiden eiwitten.
Protocol
Representative Results
Discussion
IL-22 speelt een essentiële rol in de aangeboren afweer en weefsel remodeling. IL-22-producerende cellen zijn geïdentificeerd ex vivo door intracellulaire kleuring. Echter, het blijft moeilijk om IL-22 expressie volgen in situ, in de normale toestand of ontstekingsaandoeningen. Dit protocol beschrijft een nieuwe werkwijze voor een IL-22 reporter muismodel, waardoor we de reporter tot expressie brengen in vivo te lokaliseren ontwikkelen. Het reportergen codeert TdTomato werd in de IL-22 locus…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We thank Kelli Czarra and Megan Karwan for animal technical assistance, Kathleen Noer and Roberta Matthai for flow cytometry assistance, and Donna Butcher andMiriam R. Anver for pathology analysis. This project was supported by a grant from the Ely and Edythe Broad Foundation (to Scott Durum) and has been funded in whole or in part with federal funds from the National Cancer Institute, National Institutes of Health, under Contract No. HHSN261200800001E (MRA).
Materials
| RP23-401E11 BAC | Thermo Fisher Scientific | RPCI23.C | Need gene ID: 50929 |
| NucleoBond BAC 100 | Takara Clontech | 740579 | |
| PCR SuperMix High Fidelity | Thermo Fisher Scientific | 10790020 | |
| PI-SceI | New England Biolabs | R0696S | |
| SpeI | New England Biolabs | R0133S | |
| LB Broth | Thermo Fisher Scientific | 10855-001 | 1L: 10 g SELECT Peptone 140, 5 g SELECT Yeast Extract, 5 g sodium chloride |
| Anti-mouse CD3 | eBioscience | 11-0031 | |
| Anti-mouse CD4 | eBioscience | 17-0041 | |
| Anti-mouse CD45 | Thermo Fisher Scientific | MCD4530 | |
| Anti-mouse CD45RB | eBioscience | 11-0455 | |
| Anti-mouse RFP | Abcam | Ab62341 | |
| HBSS, no calcium, no magnesium, no phenol red | Thermo Fisher Scientific | 14175145 | KCl, KH2PO4, Na2HPO4, NaHCO3, NaCl, D-Glucose |
| Dnase I | Roche | 10104159001 | |
| ACK lysing buffer | Thermo Fisher Scientific | A1049201 | |
| Percoll | GE healthcare life sciences | 17-0891-01 | |
| Collagenase D | Roche | 11088858001 | |
| Dispase II (neutral protease, grade II) | Roche | 4942078001 | |
| IX70 inverted fluorescence microscope | Olympus | Ask for quote | |
| Nikon Eclipse 80i microscope | Nikon | Ask for quote | |
| Dynal shaker | Electron Microscopy Science | 61050-10 | |
| FACSAria | BD Bioscience | Ask for quote | |
| LSRII SORP/flow cytometry | Becton, Dickinson and Company | Ask for quote |
Referências
- Awasthi, A., et al. Cutting edge: IL-23 receptor gfp reporter mice reveal distinct populations of IL-17-producing cells. J Immunol. 182, 5904-5908 (2009).
- Price, A. E., Reinhardt, R. L., Liang, H. E., Locksley, R. M. Marking and quantifying IL-17A-producing cells in vivo. PLoS One. 7, e39750 (2012).
- Kamanaka, M., et al. Expression of interleukin-10 in intestinal lymphocytes detected by an interleukin-10 reporter knockin tiger mouse. Immunity. 25, 941-952 (2006).
- Sonnenberg, G. F., Fouser, L. A., Artis, D. Border patrol: regulation of immunity, inflammation and tissue homeostasis at barrier surfaces by IL-22. Nat Immunol. 12, 383-390 (2011).
- Dumoutier, L., Louahed, J., Renauld, J. C. Cloning and characterization of IL-10-related T cell-derived inducible factor (IL-TIF), a novel cytokine structurally related to IL-10 and inducible by IL-9. J Immunol. 164, 1814-1819 (2000).
- Cella, M., et al. A human natural killer cell subset provides an innate source of IL-22 for mucosal immunity. Nature. 457, 722-725 (2009).
- Sanos, S. L., et al. RORgammat and commensal microflora are required for the differentiation of mucosal interleukin 22-producing NKp46+ cells. Nat Immunol. 10, 83-91 (2009).
- Spits, H., et al. Innate lymphoid cells–a proposal for uniform nomenclature. Nat Rev Immunol. 13, 145-149 (2013).
- Mazzucchelli, R. I., et al. Visualization and identification of IL-7 producing cells in reporter mice. PLoS One. 4, e7637 (2009).
- Shen, W., Hixon, J. A., McLean, M. H., Li, W. Q., Durum, S. K. IL-22-Expressing Murine Lymphocytes Display Plasticity and Pathogenicity in Reporter Mice. Front Immunol. 6, 662 (2015).
- Gong, S., Yang, X. W., Li, C., Heintz, N. Highly efficient modification of bacterial artificial chromosomes (BACs) using novel shuttle vectors containing the R6Kgamma origin of replication. Genome Res. 12, 1992-1998 (2002).
- Shen, W., Huang, Y., Tang, Y., Liu, D. P., Liang, C. C. A general method to modify BACs to generate large recombinant DNA fragments. Mol Biotechnol. 31, 181-186 (2005).
- Cho, A., Haruyama, N., Kulkarni, A. B. Generation of transgenic mice. Curr Protoc Cell Biol. Chapter. Chapter 19, Unit 19 11 (2009).
- Danneman, P. J., Stein, S., Walshaw, S. O. Humane and practical implications of using carbon dioxide mixed with oxygen for anesthesia or euthanasia of rats. Lab Anim Sci. 47, 376-385 (1997).
- Omata, Y., et al. Isolation of coccidian enteroepithelial stages of Toxoplasma gondii from the intestinal mucosa of cats by Percoll density-gradient centrifugation. Parasitol Res. 83, 574-577 (1997).
- Kumar, N., Borth, N. Flow-cytometry and cell sorting: an efficient approach to investigate productivity and cell physiology in mammalian cell factories. Methods. 56, 366-374 (2012).
- Fischer, A. H., Jacobson, K. A., Rose, J., Zeller, R. Cryosectioning tissues. CSH Protoc. 2008, pdb.prot4991 (2008).
- Hilbe, W., et al. Comparison of automated cellular imaging system and manual microscopy for immunohistochemically stained cryostat sections of lung cancer specimens applying p53, ki-67 and p120. Oncol Rep. 10, 15-20 (2003).
- Suzuki, Y., Furukawa, M., Abe, J., Kashiwagi, M., Hirose, S. Localization of porcine trappin-2 (SKALP/elafin) in trachea and large intestine by in situ hybridization and immunohistochemistry. Histochem Cell Biol. 114, 15-20 (2000).
- Wolk, K., et al. IL-22 increases the innate immunity of tissues. Immunity. 21, 241-254 (2004).
- Brand, S., et al. IL-22 is increased in active Crohn’s disease and promotes proinflammatory gene expression and intestinal epithelial cell migration. Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol. 290, G827-G838 (2006).
- Nagalakshmi, M. L., Rascle, A., Zurawski, S., Menon, S., Waal Malefyt, d. e., R, Interleukin-22 activates STAT3 and induces IL-10 by colon epithelial cells. Int Immunopharmacol. 4, 679-691 (2004).
- Maloy, K. J., Powrie, F. Intestinal homeostasis and its breakdown in inflammatory bowel disease. Nature. 474, 298-306 (2011).
- Andoh, A., et al. Interleukin-22, a member of the IL-10 subfamily, induces inflammatory responses in colonic subepithelial myofibroblasts. Gastroenterology. 129, 969-984 (2005).
- Bhan, A. K., Mizoguchi, E., Smith, R. N., Mizoguchi, A. Colitis in transgenic and knockout animals as models of human inflammatory bowel disease. Immunol Rev. 169, 195-207 (1999).
- Mombaerts, P., et al. Spontaneous development of inflammatory bowel disease in T cell receptor mutant mice. Cell. 75, 274-282 (1993).
- Powrie, F. Immune regulation in the intestine: a balancing act between effector and regulatory T cell responses. Ann N Y Acad Sci. 1029, 132-141 (2004).
- Ahlfors, H., et al. IL-22 fate reporter reveals origin and control of IL-22 production in homeostasis and infection. J Immunol. 193, 4602-4613 (2014).
