Visualisation de l'IL-22 exprimant Lymphocytes en utilisant des souris Reporter
Summary
We describe here a transgenic reporter mouse model to visualize the IL-22-producing cells inside different mouse tissues. This method can be used to track the location of other cytokines or secretary proteins in the mouse.
Abstract
Des souris rapporteurs ont été largement utilisés pour observer la localisation de l'expression des gènes ciblés. Ce protocole met l'accent sur une stratégie visant à établir un nouveau modèle de souris transgénique journaliste. Nous avons choisi de visualiser l'interleukine (IL) 22 l'expression des gènes, car cette cytokine a des activités importantes dans l'intestin, où elle contribue à réparer les tissus endommagés par l'inflammation. Les systèmes rapporteurs offrent des avantages considérables par rapport aux autres procédés permettant d'identifier les produits in vivo. Dans le cas de l' IL-22, d' autres études ont d' abord isolé les cellules des tissus, puis re-stimulé les cellules in vitro. IL-22, qui est normalement sécrétée, est emprisonné à l'intérieur des cellules à l'aide d'un médicament, et une coloration intracellulaire a été utilisé pour visualiser. Cette méthode identifie les cellules capables de produire de l' IL-22, mais il ne détermine pas si elles le faisaient in vivo. La conception reporteur comprend l'insertion d'un gène pour une protéine fluorescente (tdTomato) dans le gène IL-22 dans un tel way que la protéine fluorescente ne peut être sécrété et donc reste piégée à l' intérieur des cellules productrices in vivo. Producteurs fluorescentes peuvent ensuite être visualisées dans des coupes de tissus ou par une analyse ex vivo par cytométrie de flux. Le processus de construction proprement dite pour le journaliste inclus recombineering un chromosome artificiel bactérien qui contenait le gène IL-22. Ce chromosome manipulé est ensuite introduit dans le génome de la souris. Homéostatique de l'IL-22 reporteur expression a été observée dans les tissus de souris différentes, y compris la rate, le thymus, les ganglions lymphatiques, les plaques de Peyer, et de l'intestin, par cytométrie de flux. Colite a été induite par des cellules T (CD4 + CD45RBhigh) le transfert et l' expression du journaliste a été visualisé. Les cellules T positives sont d'abord présentes dans les ganglions lymphatiques mésentériques, puis ils se sont accumulés à l'intérieur de la lamina propria des petits tissus de l'intestin grêle et du côlon distal. La stratégie utilisant BACs a donné une bonne fidélité reporter l'expression par rapport à l'IL-22 expression, et il est plus simple que les procédures knock-in.
Introduction
Cellule expression spécifique du type de gènes rapporteurs est utile pour identifier les cellules exprimant activement la cible dans les tissus sous état homéostatique et perturbés. Elle permet aussi la purification de ces cellules, qui restent viables, pour étudier leurs autres propriétés. Des souris rapporteurs ont été utilisés dans l'élucidation du mécanisme d'action de cytokines spécifiques, des facteurs de transcription, et des éléments régulateurs. Stratégies Précédent 1, 2, 3 ont largement compté sur frapper le journaliste dans le locus cible dans le chromosome de la souris, une procédure fastidieuse et coûteuse. Ainsi, un procédé plus simple pour la génération de souris rapporteurs est souhaitable.
Les cytokines sont une large classe de petites protéines sécrétées / peptides qui régulent les réponses immunitaires par le biais de la signalisation intercellulaire. Interleukine 22 (IL-22) est une cytokine avec beaucoup rapporté activités, y compris la barrière function, la réparation des tissus, et l' inflammation 4. Bien que l' IL-22 a d' abord été découvert en tant que produit des cellules T 5, les rapports subséquents ont démontré son expression dans tueuses naturelles (cellules NK) chez les humains et les souris 6 7 et dans d' autres classes de lymphocytes innées 8. Malgré une vaste observation de cellules-22 produisant IL, la visualisation de l' IL-22 précédemment nécessaire stimulation ex vivo et perméabilisation aux taches avec des anticorps. Par conséquent, le roman IL-22 souris rapporteurs serait un outil très utile pour étudier la fonction de l'IL-22 dans les processus homéostatique et pathogènes.
Ici, nous avons développé un modèle de souris transgénique journaliste simplifiée pour observer les cellules IL-22 produisant in vivo et in vitro. En utilisant une méthode BAC recombineering 9, nous avons inséré la séquence tdTomato ADNc avec Poly A fragments de signal dans l'IL-22 locnous et remplacé exon 1. Les autres régions, exons, et des éléments régulateurs non traduites ne sont pas perturbés, puisque nous voudrions imiter la régulation naturelle de l'IL-22, autant que possible. Le site d'insertion reporteur perturbe la séquence signal, ce qui entraîne l'accumulation du reporteur dans les cellules productrices, contrairement à l'IL-22 elle-même, qui est rapidement sécrété. Ce nouveau procédé peut également être appliqué à la production de souris rapporteurs pour d'autres protéines sécrétées.
Protocol
Representative Results
Discussion
IL-22 joue un rôle essentiel dans la défense de l'hôte et le remodelage des tissus innées. Des cellules de production d' IL-22 ont été identifiées par une coloration ex vivo intracellulaire. Cependant, il reste encore difficile de suivre l' expression de l' IL-22 in situ, soit dans l'état normal ou dans des conditions inflammatoires. Ce protocole décrit une nouvelle méthode pour développer un modèle de souris reporter IL-22, ce qui nous permet de localiser les cellules r…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We thank Kelli Czarra and Megan Karwan for animal technical assistance, Kathleen Noer and Roberta Matthai for flow cytometry assistance, and Donna Butcher andMiriam R. Anver for pathology analysis. This project was supported by a grant from the Ely and Edythe Broad Foundation (to Scott Durum) and has been funded in whole or in part with federal funds from the National Cancer Institute, National Institutes of Health, under Contract No. HHSN261200800001E (MRA).
Materials
| RP23-401E11 BAC | Thermo Fisher Scientific | RPCI23.C | Need gene ID: 50929 |
| NucleoBond BAC 100 | Takara Clontech | 740579 | |
| PCR SuperMix High Fidelity | Thermo Fisher Scientific | 10790020 | |
| PI-SceI | New England Biolabs | R0696S | |
| SpeI | New England Biolabs | R0133S | |
| LB Broth | Thermo Fisher Scientific | 10855-001 | 1L: 10 g SELECT Peptone 140, 5 g SELECT Yeast Extract, 5 g sodium chloride |
| Anti-mouse CD3 | eBioscience | 11-0031 | |
| Anti-mouse CD4 | eBioscience | 17-0041 | |
| Anti-mouse CD45 | Thermo Fisher Scientific | MCD4530 | |
| Anti-mouse CD45RB | eBioscience | 11-0455 | |
| Anti-mouse RFP | Abcam | Ab62341 | |
| HBSS, no calcium, no magnesium, no phenol red | Thermo Fisher Scientific | 14175145 | KCl, KH2PO4, Na2HPO4, NaHCO3, NaCl, D-Glucose |
| Dnase I | Roche | 10104159001 | |
| ACK lysing buffer | Thermo Fisher Scientific | A1049201 | |
| Percoll | GE healthcare life sciences | 17-0891-01 | |
| Collagenase D | Roche | 11088858001 | |
| Dispase II (neutral protease, grade II) | Roche | 4942078001 | |
| IX70 inverted fluorescence microscope | Olympus | Ask for quote | |
| Nikon Eclipse 80i microscope | Nikon | Ask for quote | |
| Dynal shaker | Electron Microscopy Science | 61050-10 | |
| FACSAria | BD Bioscience | Ask for quote | |
| LSRII SORP/flow cytometry | Becton, Dickinson and Company | Ask for quote |
Referências
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