आईएल -22 व्यक्त लिम्फोसाइटों रिपोर्टर चूहों का उपयोग कर के दृश्य
Summary
We describe here a transgenic reporter mouse model to visualize the IL-22-producing cells inside different mouse tissues. This method can be used to track the location of other cytokines or secretary proteins in the mouse.
Abstract
संवाददाता चूहों व्यापक रूप से लक्षित जीनों की अभिव्यक्ति के स्थानीयकरण निरीक्षण करने के लिए इस्तेमाल किया गया है। इस प्रोटोकॉल एक रणनीति के एक नए ट्रांसजेनिक संवाददाता माउस मॉडल स्थापित करने पर केंद्रित है। हम क्योंकि इस साइटोकाइन आंत, जहां यह सूजन से क्षतिग्रस्त ऊतकों की मरम्मत के लिए योगदान करने में महत्वपूर्ण activities नहीं है इंटरल्यूकिन (IL) में 22 जीन अभिव्यक्ति कल्पना करने के लिए चुना है। रिपोर्टर सिस्टम विवो में उत्पादों की पहचान के अन्य तरीकों पर काफी लाभ प्रदान करते हैं। आईएल 22 के मामले में, अन्य अध्ययनों से पहले ऊतकों से कोशिकाओं को अलग किया था और उसके बाद इन विट्रो में कोशिकाओं को फिर से प्रेरित है। आईएल -22, जो सामान्य रूप से स्रावित होता है, कोशिकाओं के अंदर फंस गया था एक दवा का उपयोग, और intracellular धुंधला यह कल्पना करने के लिए इस्तेमाल किया गया था। इस विधि आईएल -22 के उत्पादन में सक्षम कोशिकाओं को दिखाता है, लेकिन यह तय नहीं है कि वे इन विवो में ऐसा कर रहे थे। संवाददाता डिजाइन इस तरह के एक वा में आईएल -22 जीन में एक फ्लोरोसेंट प्रोटीन (tdTomato) के लिए एक जीन डालने शामिलY कि फ्लोरोसेंट प्रोटीन और स्रावित नहीं किया जा सकता इसलिए विवो में उत्पादक कोशिकाओं के अंदर फंस रहता है। फ्लोरोसेंट उत्पादकों तो ऊतक वर्गों में या प्रवाह cytometry के माध्यम से पूर्व vivo विश्लेषण द्वारा देखे जा सकते हैं। पत्रकार के लिए वास्तविक निर्माण प्रक्रिया एक जीवाणु कृत्रिम गुणसूत्र कि आईएल -22 जीन निहित recombineering शामिल थे। इस इंजीनियर गुणसूत्र तो माउस के जीनोम में पेश किया गया था। होमियोस्टैटिक आईएल -22 संवाददाता अभिव्यक्ति तिल्ली, थाइमस, लिम्फ नोड्स, Peyer पैच, और आंत, विश्लेषण प्रवाह cytometry द्वारा सहित विभिन्न माउस ऊतकों में मनाया गया। कोलाइटिस टी-सेल (CD4 + CD45RBhigh) हस्तांतरण द्वारा प्रेरित किया गया था, और संवाददाता अभिव्यक्ति कल्पना की गई थी। सकारात्मक टी कोशिकाओं mesenteric लिम्फ नोड्स में पहली उपस्थित थे, और फिर वे बाहर का छोटी आंत और पेट के ऊतकों के पटल Propria अंदर जमा हुए। बेक्स का उपयोग कर रणनीति आईएल 22 अभिव्यक्ति की तुलना में दे दी अच्छा निष्ठा संवाददाता अभिव्यक्तिसायन, और यह दस्तक में प्रक्रियाओं की तुलना में आसान है।
Introduction
रिपोर्टर जीन की सेल प्रकार विशिष्ट अभिव्यक्ति सक्रिय रूप से होमियोस्टैटिक और परेशान राज्यों तहत ऊतकों में लक्ष्य व्यक्त कोशिकाओं की पहचान के लिए उपयोगी है। यह भी इन कोशिकाओं है, जो व्यवहार्य बने हुए हैं, उनके अन्य गुणों का अध्ययन करने की शुद्धि के लिए अनुमति देता है। संवाददाता चूहों विशिष्ट साइटोकिन्स, प्रतिलेखन कारक है, और नियामक तत्वों के लिए कार्रवाई के तंत्र का वर्णन में उपयोग किया गया है। पिछला रणनीतियों 1, 2, 3 बड़े पैमाने पर माउस गुणसूत्र, एक समय लेने वाली और महंगी प्रक्रिया में लक्ष्य लोकस में रिपोर्टर दस्तक पर भरोसा किया है। इस प्रकार, संवाददाता चूहों की पीढ़ी के लिए एक सरल विधि वांछनीय है।
साइटोकिन्स छोटे, स्रावित प्रोटीन / पेप्टाइड्स कि कहनेवाला संकेत के माध्यम से प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया को विनियमित के एक व्यापक वर्ग के हैं। इंटरल्यूकिन 22 (आईएल 22) कई के साथ एक साइटोकाइन गतिविधियों की सूचना दी, बाधा फू सहितnction, ऊतकों की मरम्मत, और सूजन 4। आईएल -22 शुरू में एक टी सेल उत्पाद के रूप में 5 की खोज की थी हालांकि, बाद में रिपोर्टों इंसानों और चूहों 6 7 में और जन्मजात लिम्फोसाइट 8 के अन्य वर्गों में प्राकृतिक हत्यारा कोशिकाओं (एन.के.) में अपनी अभिव्यक्ति का प्रदर्शन किया। एंटीबॉडी के साथ दाग को आईएल -22 उत्पादक कोशिकाओं के व्यापक अवलोकन, आईएल -22 पहले से अपेक्षित पूर्व vivo उत्तेजना और permeabilization के दृश्य के बावजूद। इसलिए, उपन्यास आईएल -22 संवाददाता चूहों होमियोस्टैटिक और रोगजनक प्रक्रियाओं में आईएल 22 के समारोह में जांच करने के लिए एक बहुत ही उपयोगी उपकरण होगा।
यहाँ, हम vivo में इन विट्रो में आईएल -22 उत्पादक कोशिकाओं का निरीक्षण करने के लिए एक सरल ट्रांसजेनिक संवाददाता माउस मॉडल विकसित किया है। एक बीएसी recombineering विधि 9 का उपयोग कर, हम tdTomato सीडीएनए अनुक्रम पाली के साथ एक संकेत टुकड़े आईएल -22 नियंत्रण रेखा में डालाअमेरिका और एक्सॉन 1. की जगह अन्य ग़ैर-अनुवादित क्षेत्रों, एक्सॉनों, और विनियामक तत्वों, परेशान नहीं कर रहे थे जब से हम जितना संभव हो आईएल 22 के प्राकृतिक विनियमन की नकल करना चाहते हैं। संवाददाता प्रविष्टि की साइट के संकेत अनुक्रम बाधित, उत्पादक कोशिकाओं के अंदर रिपोर्टर के संचय में जिसके परिणामस्वरूप, आईएल 22 ही है, जो तेजी से स्रावित होता है के विपरीत है। इस नई विधि को भी अन्य स्रावित प्रोटीन के लिए संवाददाता चूहों की पीढ़ी के लिए लागू किया जा सकता है।
Protocol
Representative Results
Discussion
आईएल 22 जन्मजात मेजबान रक्षा और ऊतक remodeling में एक आवश्यक भूमिका निभाता है। आईएल -22 उत्पादक कोशिकाओं पूर्व vivo intracellular धुंधला द्वारा पहचान की गई है। हालांकि, यह अभी भी बगल में आईएल -22 अभिव्यक्ति ट्रैक करने ?…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We thank Kelli Czarra and Megan Karwan for animal technical assistance, Kathleen Noer and Roberta Matthai for flow cytometry assistance, and Donna Butcher andMiriam R. Anver for pathology analysis. This project was supported by a grant from the Ely and Edythe Broad Foundation (to Scott Durum) and has been funded in whole or in part with federal funds from the National Cancer Institute, National Institutes of Health, under Contract No. HHSN261200800001E (MRA).
Materials
| RP23-401E11 BAC | Thermo Fisher Scientific | RPCI23.C | Need gene ID: 50929 |
| NucleoBond BAC 100 | Takara Clontech | 740579 | |
| PCR SuperMix High Fidelity | Thermo Fisher Scientific | 10790020 | |
| PI-SceI | New England Biolabs | R0696S | |
| SpeI | New England Biolabs | R0133S | |
| LB Broth | Thermo Fisher Scientific | 10855-001 | 1L: 10 g SELECT Peptone 140, 5 g SELECT Yeast Extract, 5 g sodium chloride |
| Anti-mouse CD3 | eBioscience | 11-0031 | |
| Anti-mouse CD4 | eBioscience | 17-0041 | |
| Anti-mouse CD45 | Thermo Fisher Scientific | MCD4530 | |
| Anti-mouse CD45RB | eBioscience | 11-0455 | |
| Anti-mouse RFP | Abcam | Ab62341 | |
| HBSS, no calcium, no magnesium, no phenol red | Thermo Fisher Scientific | 14175145 | KCl, KH2PO4, Na2HPO4, NaHCO3, NaCl, D-Glucose |
| Dnase I | Roche | 10104159001 | |
| ACK lysing buffer | Thermo Fisher Scientific | A1049201 | |
| Percoll | GE healthcare life sciences | 17-0891-01 | |
| Collagenase D | Roche | 11088858001 | |
| Dispase II (neutral protease, grade II) | Roche | 4942078001 | |
| IX70 inverted fluorescence microscope | Olympus | Ask for quote | |
| Nikon Eclipse 80i microscope | Nikon | Ask for quote | |
| Dynal shaker | Electron Microscopy Science | 61050-10 | |
| FACSAria | BD Bioscience | Ask for quote | |
| LSRII SORP/flow cytometry | Becton, Dickinson and Company | Ask for quote |
Referências
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