レポーターマウスを用いたIL-22を発現するリンパ球の可視化
Summary
We describe here a transgenic reporter mouse model to visualize the IL-22-producing cells inside different mouse tissues. This method can be used to track the location of other cytokines or secretary proteins in the mouse.
Abstract
レポーターマウスを広く標的遺伝子の発現の局在を観察するために使用されています。このプロトコルは、新しいトランスジェニックレポーターマウスモデルを確立するための戦略に焦点を当てています。我々は、このサイトカインが炎症によって損傷を受けた組織を修復するために寄与する腸における重要な活性を有するので、インターロイキン（IL）22遺伝子の発現を可視化することを選択しました。レポーター系は、 インビボの製品を特定する他の方法に比べてかなりの利点を提供します。 IL-22の場合には、他の研究は、最初の組織から細胞を単離した、その後、インビトロで細胞を再刺激しました。 IL-22、通常は分泌され、薬剤を使用して細胞内に閉じ込められた、そして細胞内染色は、それを視覚化するために使用されました。この方法は、IL-22を産生する能力を有する細胞を識別し、それは彼らが、in vivoでそのようにやっていたかどうかを決定するものではありません。レポーターのデザインは、ワシントン州にあるIL-22遺伝子に蛍光タンパク質（tdTomato）の遺伝子を挿入するステップを含みます蛍光タンパク質を分泌することができないため、 生体内での産生細胞の中に閉じ込められたままであることのy。蛍光の生産は、フローサイトメトリーを介して組織切片またはエキソビボ分析によって可視化することができます。レポーターのための実際の建設プロセスは、IL-22遺伝子を含む細菌人工染色体をコンビニアリング含まれています。この操作された染色体は、その後、マウスゲノムに導入しました。恒常的なIL-22レポーターの発現は、フローサイトメトリー分析により、脾臓、胸腺、リンパ節、パイエル板、および腸を含む種々のマウス組織において観察されました。大腸炎は、T細胞（CD4 + CD45RBhigh）転写によって誘導し、そしてレポーター発現を可視化しました。陽性のT細胞は、腸間膜リンパ節内の最初に存在した後、それらは、遠位小腸および結腸組織の固有層内に蓄積しました。 BACを用いた戦略は、IL-22 EXPRESに比べて良好な忠実度のレポーター発現を与えましたシオン、それがノックイン手順よりも簡単です。
Introduction
レポーター遺伝子の細胞型特異的発現を積極的恒常性と摂動状態の下で組織に標的を発現する細胞を同定するのに有用です。また、そのほかの特性を研究するために、生存したままでこれらの細胞の精製を可能にします。レポーターマウスは、特定のサイトカイン、転写因子、および調節要素の作用機序の解明に利用されています。以前の戦略1、2、3は、主にマウス染色体、時間とコストのかかる手順で標的遺伝子座にレポーターをノッキングに頼ってきました。したがって、レポーターマウスを生成するための簡単な方法が望ましいです。
サイトカインは、細胞間のシグナル伝達を介して免疫応答を調節する小、分泌タンパク質/ペプチドの幅広いクラスです。インターロイキン22（IL-22）障壁のfuを含む多く報告された活動、とサイトカインでありますnction、組織修復、及び炎症4。 IL-22は当初、T細胞の生成物5として発見されたものの、その後のレポートは人間6およびマウス7で先天性リンパ球8の他のクラスにナチュラルキラー（NK）細胞におけるその発現を示しました。 IL-22産生細胞の広範囲観察にもかかわらず、IL-22の可視化は、以前に抗体を用いた汚れにex vivoで刺激し、透過処理を必要としました。そのため、新規のIL-22レポーターマウスは、恒常性と発病過程におけるIL-22の機能を調べるために非常に有用なツールになります。
ここでは、in vivoおよびde vitroで IL-22産生細胞を観察するために簡略化されたトランスジェニックレポーターマウスモデルを開発しました。 BACのコンビニアリング法9を使用して、我々は、IL-22 LOCにポリ信号断片とtdTomato cDNA配列を挿入しました私たちと私たちはできるだけIL-22の自然調節を模倣したいと思いますので、他の非翻訳領域、エクソン、および調節要素は、乱されていなかったエクソン1を取り替えました。レポーターの挿入部位を急速に分泌されるIL-22自体とは異なり、生細胞内部のレポーターの蓄積をもたらす、シグナル配列を破壊します。この新しい方法はまた、他の分泌タンパク質のためのレポーターマウスの作製に適用することができます。
Protocol
Representative Results
Discussion
IL-22は、先天性宿主防御と組織リモデリングに重要な役割を果たしています。 IL-22産生細胞は、細胞内染色によってエキソビボで同定されています。しかし、それはまだ正常な状態または炎症状態のいずれかで、 その場での IL-22の発現を追跡することが困難なままです。このプロトコルは、 生体内でのレポーター発現細胞を局在化することを可能にIL-22レポーターマウス…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We thank Kelli Czarra and Megan Karwan for animal technical assistance, Kathleen Noer and Roberta Matthai for flow cytometry assistance, and Donna Butcher andMiriam R. Anver for pathology analysis. This project was supported by a grant from the Ely and Edythe Broad Foundation (to Scott Durum) and has been funded in whole or in part with federal funds from the National Cancer Institute, National Institutes of Health, under Contract No. HHSN261200800001E (MRA).
Materials
| RP23-401E11 BAC | Thermo Fisher Scientific | RPCI23.C | Need gene ID: 50929 |
| NucleoBond BAC 100 | Takara Clontech | 740579 | |
| PCR SuperMix High Fidelity | Thermo Fisher Scientific | 10790020 | |
| PI-SceI | New England Biolabs | R0696S | |
| SpeI | New England Biolabs | R0133S | |
| LB Broth | Thermo Fisher Scientific | 10855-001 | 1L: 10 g SELECT Peptone 140, 5 g SELECT Yeast Extract, 5 g sodium chloride |
| Anti-mouse CD3 | eBioscience | 11-0031 | |
| Anti-mouse CD4 | eBioscience | 17-0041 | |
| Anti-mouse CD45 | Thermo Fisher Scientific | MCD4530 | |
| Anti-mouse CD45RB | eBioscience | 11-0455 | |
| Anti-mouse RFP | Abcam | Ab62341 | |
| HBSS, no calcium, no magnesium, no phenol red | Thermo Fisher Scientific | 14175145 | KCl, KH2PO4, Na2HPO4, NaHCO3, NaCl, D-Glucose |
| Dnase I | Roche | 10104159001 | |
| ACK lysing buffer | Thermo Fisher Scientific | A1049201 | |
| Percoll | GE healthcare life sciences | 17-0891-01 | |
| Collagenase D | Roche | 11088858001 | |
| Dispase II (neutral protease, grade II) | Roche | 4942078001 | |
| IX70 inverted fluorescence microscope | Olympus | Ask for quote | |
| Nikon Eclipse 80i microscope | Nikon | Ask for quote | |
| Dynal shaker | Electron Microscopy Science | 61050-10 | |
| FACSAria | BD Bioscience | Ask for quote | |
| LSRII SORP/flow cytometry | Becton, Dickinson and Company | Ask for quote |
Referências
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